人類NARF基因功能的初步研究.pdf

1、背景與目的：A型核纖層蛋白前體(prelamin A)經(jīng)過加工成為成熟的A型核纖層蛋白(lamin A)，該蛋白是細(xì)胞核纖層的重要組成成分。lamin A的正常加工成熟和在核纖層中的穩(wěn)定存在，對維持穩(wěn)定的核形態(tài)和染色質(zhì)定位以及基因表達(dá)至關(guān)重要。lamin A的編碼基因LMNA不同的突變會導(dǎo)致截然不同的疾病及表型，包括兒童早老癥Hutchinson-Gilford progeria syndrome(HGPS)及多種其他類型疾病。在HGP

2、S患者細(xì)胞中LMNA突變導(dǎo)致prelamin A的加工異常，進(jìn)而出現(xiàn)突變蛋白progerin在細(xì)胞中堆積并引起細(xì)胞出現(xiàn)衰老農(nóng)型。Prelamin A加工所需的金屬蛋白酶Zmpste24缺失的Zmpste24-/-小鼠細(xì)胞內(nèi)由于prelamin A不能被正常加工變成成熟的lamin A，導(dǎo)致prelamin A在胞內(nèi)大量堆積，也表現(xiàn)出典型的早衰癥狀。對于異常的核纖層蛋白堆積如何導(dǎo)致早衰的確切機(jī)理尚不清楚。為研究這些異常的核纖層蛋白在細(xì)胞中

3、堆積導(dǎo)致早衰的確切機(jī)理，本研究選擇通過酵母雙雜交篩選到的A型核纖層蛋白前體識別因子Narf(nuclear prelamin Arecognition factor)為對象，研究該蛋白在細(xì)胞中的定位，改變其在細(xì)胞中的襲達(dá)觀察對細(xì)胞增殖、衰老等的影響，初步揭示Narf蛋白在異常核纖層蛋白引起的細(xì)胞衰老過程中的功能作用，為相關(guān)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：構(gòu)建Narf-GFP融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測Narf在細(xì)胞內(nèi)的

4、定位，并檢測Narf與prelamin A的熒光共定位驗(yàn)征兩者的相互作用。運(yùn)用qRT-PCR的方法檢測Narf在正常和衰老細(xì)胞中的表達(dá)是否存征差異。分別在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)和RNAi方法沉默Narf表達(dá)，采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，并用β-半乳糖苷酶活性檢測細(xì)胞衰老，Western blotting方法檢測Narf過表達(dá)和沉默細(xì)胞中l(wèi)amin A/C和p53蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：熒光共定位結(jié)果顯

5、示Narf定位于細(xì)胞核，主要分布于核膜附近，過表達(dá)的Narf與prelamin A蛋白能很好地定位于核纖層，進(jìn)一步證明二者存細(xì)胞內(nèi)的相互作用。qRT-PCR結(jié)果表明在衰老細(xì)胞中Narf的表達(dá)明顯上調(diào)。細(xì)胞中Narf過表達(dá)能抑制細(xì)胞的增殖、促使細(xì)胞停滯于G0/G1期，并導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)哀老和凋亡的現(xiàn)象；而Narf的沉默則能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，促使細(xì)胞渡過G0/G1期，同時對細(xì)胞凋亡以及衰老沒有明顯的影響。Western blotting榆測結(jié)果顯