Narf及其同源基因Narl結(jié)構(gòu)功能的初步研究.pdf

1、背景與目的：世界人口正面臨嚴(yán)重的老齡化問題，中國也逐步步入老年社會，衰老機(jī)理的研究及老年性疾病的診斷和預(yù)防顯得十分緊迫和重要。通常機(jī)體老化是緩慢漸進(jìn)的，利用一些基因突變引起的早衰模型來研究正常衰老過程的分子機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。酵母細(xì)胞培養(yǎng)容易，繁殖迅速，特別是存在眾多的突變體，因而成為衰老研究的理想模型。A型核纖層蛋白前體(prelamin A)C末端不能被剪切或異常剪切50個氨基酸殘基均導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型，說明其C末端對細(xì)胞的衰

2、老進(jìn)程有重要影響，prelamin A特異識別因子Narf在該過程中可能起著重要作用，與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。本研究在已經(jīng)證明Narf與prelamin A相互作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究Narf的細(xì)胞定位以及其與prelamin A結(jié)合的區(qū)域，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。通過構(gòu)建Narf在釀酒酵母中的同源基因Narl基因敲除突變株，探討了Narl在酵母細(xì)胞衰老和生長過程中的功能。
　　 方法：將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Na

3、rf單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與pDsRed1-N1-prelamin A共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的定位情況；采用PCR方法擴(kuò)增得到Narf不同區(qū)域的片段，插入到pACT2載體上構(gòu)建一系列重組質(zhì)粒，與已構(gòu)建的含prelamin A cDNA的BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，篩選能夠發(fā)生相互作用的區(qū)域；利用同源重組的方法構(gòu)建Narl基因缺失的酵母突變株，并分析其對酵母的壽命和生長的影響。
　　 結(jié)果：Narf蛋白定位于

4、細(xì)胞核中，并呈現(xiàn)點(diǎn)狀高表達(dá)的現(xiàn)象，但當(dāng)同時轉(zhuǎn)染prelamin A時，Narf蛋白則主要與prelamin A共定位于核周，且點(diǎn)狀高表達(dá)現(xiàn)象消失；Narf蛋白的C末端缺失對prelamin A與Narf的相互作用沒有影響；NARl/narl基因缺失突變雜合菌株的壽命縮短且抗氧化應(yīng)激能力下降。
　　 結(jié)論：Narf蛋白與prelamin A蛋白在HEK293細(xì)胞中存在共定位，進(jìn)一步說明它們在體內(nèi)存在相互作用。Narlp在酵母的壽命