鴨TLR4基因的克隆及其功能初步研究.pdf

1、Toll樣受體(Toll like receptor，TLRs)是一種介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的病原模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），能識(shí)別表達(dá)在病原微生物上的高度保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，并將信號(hào)向下游傳遞，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。目前TLR4已成為TLRs家族之中研究最熱門的成員之一。TL

2、R4作為動(dòng)物疾病易感性相關(guān)的候選基因，已被廣泛認(rèn)可。且最近研究發(fā)現(xiàn)在豬、綿羊、小鼠等生物上存在TLR4基因的可變剪接體，而在鴨上是否也同樣具有可變剪接的形式，TLR4功能又如何，目前尚未見有報(bào)道。
　　本研究通過克隆、鑒定鴨TLR4基因及其可變剪接體，利用qRT-PCR分析各可變剪接體在鴨組織及在LPS刺激鴨胚成纖維細(xì)胞前后表達(dá)變化，確定主要剪接形式。并構(gòu)建pcDNA3.1+-TLR4過表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到鴨胚成纖維細(xì)胞，利用po

3、lyI∶C和LPS模擬病毒和細(xì)菌來建立病毒和細(xì)菌感染模型，探討TLR4信號(hào)通路中IL-1β、IL6和MHCⅡ等相關(guān)基因表達(dá)變化，研究旨在初步探明鴨TLR4基因可變剪接形式的存在性，及闡述主要剪接形式的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，初步闡明TLR4基因在鴨抵抗細(xì)菌感染和病毒感染中的功能，為今后研究禽類天然免疫奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為培育天然抗病鴨品種提供基因資源。
　　1.本研究利用RT-PCR和LD-PCR技術(shù)，獲得了鴨TLR4基因CDS序列以及DN

4、A序列全長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，duTLR4基因長(zhǎng)為2532 bp，包含3外顯子和2內(nèi)含子，并獲得鴨TLR4基因一種新的可變剪接體(TLR4b)，長(zhǎng)為3367 bp，經(jīng)鑒定其剪接形式為跨內(nèi)含子剪接。
　　2.采用qRT-PCR檢測(cè)兩種可變剪接體在各組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胸腺、肺、脾臟、肝臟、腎臟等組織中，TLR4a基因的表達(dá)量都遠(yuǎn)高于TLR4b。通過構(gòu)建LPS感染鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)模型，利用qRT-PCR方法檢測(cè)TLR4a、TLR4

5、b基因在空白組、LPS感染處理組不同感染點(diǎn)的mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明，TLR4基因的表達(dá)主要以TLR4a為主，且在LPS抗原刺激后，DEF細(xì)胞中TLR4a mRNA表達(dá)量總體表現(xiàn)為先上升，后下降，而TLR4b表達(dá)總體變化不大，表明TLR4其功能主要取決于TLR4a。
　　3.為了進(jìn)一步探討duTLR4a功能，構(gòu)建了pcDNA3.1+-TLR4真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入DEF，經(jīng)LPS和polyI∶C刺激后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示

6、，在LPS和polyI∶C刺激12h內(nèi)，IL-1β、IL6和MHCⅡ表達(dá)量都升高，且具有時(shí)效關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證TLR4a在抗病毒感染中作用，通過構(gòu)建PolyI∶C感染雛鴨活體模型，利用qRT-PCR方法檢測(cè)TLR4a mRNA不同組織中的的表達(dá)量，結(jié)果表明，在polyI∶C等抗原刺激后，肺、脾臟等組織中TLR4amRNA表達(dá)量總體表現(xiàn)為先上升，后下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了duTLR4不僅在機(jī)體抗細(xì)菌感染發(fā)揮作用，而且在抗病毒感染過程同樣