TLR4參與肝細胞的糖代謝作用和初步機制的研究.pdf

1、目的:研究TLR4在各類肝細胞中的表達，探討胰島素對于TLR4的受體調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)肝臟糖代謝疾病的新的分子表征。
　　方法:選用正常人肝細胞QSG-7701、HL-7702、THLE-2和大鼠肝細胞BRL-3A，以及肝癌細胞LM3和HepG2細胞系作為研究對象。
　　1、采用PCR和WB法檢測TLR4在各種肝細胞中分布情況。
　　2、采用siRNA/TLR4沉默肝臟正常細胞中的TLR4，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
　　

2、3、采用建立好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株作為研究對象，胰島素和LPS刺激作用后，用PCR和WB法，分別從mRNA和蛋白水平檢測TLR4和能量代謝基因PFKFB3的表達情況。
　　4、采用體外劃痕愈合實驗觀察TLR4對肝細胞遷移能力的影響，transwell小室侵襲試驗觀察TLR4對肝細胞侵襲能力的影響。
　　5、采用流式細胞術(shù)觀察TLR4對肝細胞周期的影響，磷脂酰絲氨酸外翻法（AnnexinⅤ和PI雙染法）檢測TLR4對肝細胞凋亡的影

3、響。采用JC-1檢測試劑盒檢測細胞線粒體跨膜電位。
　　6、采用ATP含量檢測試劑盒等，檢測TLR4對肝細胞中ATP能量代謝指標(biāo)變化的影響。
　　7、采用PCR法檢測TLR4在臨床標(biāo)本中表達情況
　　結(jié)果:1、TLR4，這個炎性因子在正常肝細胞內(nèi)的表達，高于肝臟腫瘤細胞。PFKFB3，這個能量代謝相關(guān)基因，在正常肝細胞內(nèi)的分布低于肝臟腫瘤細胞
　　2、siRNA TLR4作用后，肝細胞株內(nèi)TLR4被沉默，同時，P

4、FKFB3基因表達也會下調(diào)了。胰島素刺激作用后，正常肝細胞內(nèi)的TLR4表達上升，PFKFB3的表達也有增強。胰島素作用于TLR4被沉默的肝細胞，TLR4表達稍有上升，PFKFB3的表達也略微有上升，但是仍然低于正常水平。
　　3、TLR4被沉默的肝細胞，生長能力下降，胰島素作用后有所提高。
　　4、TLR4被沉默的肝細胞，G0期細胞數(shù)量上升，胰島素作用后有所下降。
　　5、TLR4被沉默的肝細胞，凋亡細胞數(shù)量上升，胰島

5、素作用后有所下降。
　　6、TLR4被沉默的肝細胞，線粒體膜電位明顯下降，胰島素作用后有所上升。
　　7、中國漢族人群未發(fā)現(xiàn)有雜合子或299Gly、399Ile純合子的存在TLR4多態(tài)性
　　結(jié)論:1、TLR4受體在正常肝細胞內(nèi)的表達高于肝腫瘤細胞，而能量代謝相關(guān)基因PFKFB3，在肝腫瘤細胞內(nèi)的表達高于正常肝細胞。
　　2、TLR4參與肝細胞的糖代謝，有可能與調(diào)控PFKFB3基因相關(guān)，胰島素是TLR4調(diào)控的刺激