FoxO1調(diào)控鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝作用研究.pdf

1、研究目的:肝臟在維持機(jī)體糖脂代謝平衡中起重要作用。近年來，叉頭框蛋白1(FoxO1)成為研究胰島素抵抗，肥胖以及2型糖尿病的熱點基因，暗示其在脂質(zhì)代謝中存在作用。本實驗以鵝原代肝細(xì)胞為實驗材料，通過轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒，添加胰島素以及NVP-BEZ235處理鵝肝細(xì)胞，采用熒光定量PCR法、western blot蛋白檢測法，Elisa試劑盒檢測法以及油紅O染色法檢測脂肪酸合成，VLDL-TG分泌轉(zhuǎn)運以及脂肪酸氧化途徑的相關(guān)指標(biāo)來反映脂

2、質(zhì)代謝的變化，分析胰島素通過FoxO1調(diào)控鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用，探討FoxO1對肝臟脂質(zhì)代謝的作用是否是由PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)的，以期進(jìn)一步闡明轉(zhuǎn)錄因子FoxO1在鵝肝臟脂質(zhì)代謝過程中的作用，為探討胰島素、PI3K-Akt信號通路以及FoxO1在肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝作用的分子機(jī)制及其對基因水平的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)染pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-FoxO1質(zhì)粒24小時后細(xì)胞內(nèi)總Fo

3、xO1蛋白含量顯著下調(diào)，熒光定量PCR檢測顯示FoxO1干擾效率達(dá)51.2％，表明干擾FoxO1表達(dá)成功。
　　2、胰島素處理肝細(xì)胞使FoxO1磷酸化增加，mRNA表達(dá)量減少進(jìn)而其活性降低，相反NVP-BEZ235處理使FoxO1基因mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量增加(P＜0.05)，表明胰島素能抑制FoxO1活性而NVP-BEZ235使FoxO1活性增加。
　　3、FoxO1干擾能顯著降低Akt的mRNA的表達(dá)水平，而增加mT

4、ORc1的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05);western blot檢測結(jié)果顯示FoxO1干擾能降低Akt的磷酸化水平，增加mTORc1的蛋白表達(dá)，表明FoxO1能調(diào)節(jié)Akt和mTORc1基因的表達(dá)。
　　4、鵝肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒后，F(xiàn)AS、ACCα、CPT1、ACOX1、MTP、ApoB基因mRNA表達(dá)量和激酶表達(dá)量于對照組顯著減少(P＜0.05)，DGAT1表達(dá)量增加，其中，SREBP1、DGAT2、PPARα和PP

5、ARγ基因mRNA表達(dá)量與對照組無明顯差異(P＜0.05)。Western blot檢測ACCα、CPT1、MTP蛋白含量顯示，F(xiàn)oxO1干擾后ACCα和MTP蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組，CPT1則無顯著變化。油紅O染色顯示鵝肝細(xì)胞干擾FoxO1使細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒增多，脂質(zhì)沉積明顯，同時細(xì)胞內(nèi)外TG含量增加，而胞外VLDL含量減少。
　　5、胰島素處理鵝肝細(xì)胞后CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARα和PPAR基因mRNA

6、表達(dá)量降低，同時增加了ACCα、 FAS、SREBP1、DGAT1和DGAT1基因的表達(dá)，同時western blot和Elisa檢測CPT1和MTP均顯示出與mRNA表達(dá)水平類似的結(jié)果。同時，油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴增多。另外，在胰島素處理肝細(xì)胞后轉(zhuǎn)染FoxO1干擾質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARα和PPARγ基因mRNA表達(dá)量也顯著低于對照組且比單獨的胰島素處理更為明顯(P＜0.05)，然而，SREBP1和

7、DGAT1的表達(dá)量增加，ACCα和FAS基因的mRNA表達(dá)量則與對照組無顯著差異;此外，檢測細(xì)胞內(nèi)外TG含量發(fā)現(xiàn)均高于對照組，而細(xì)胞外VLDL含量減少;同時油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脂滴顆粒增多，脂質(zhì)沉積增加。
　　6、鵝肝細(xì)胞經(jīng)過NVP-BEZ235處理阻斷PI3K-Akt-mTORc1信號通路后，發(fā)現(xiàn)ACCα、FAS、SREBP1、DGAT1和DGAT1基因的表達(dá)量降低，CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARα和PPARγ基