Rab32通過ATGL調控脂質水解影響肝細胞內脂質蓄積.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他肝損傷因素所導致的肝細胞內脂質異常蓄積的一類疾病。目前對于非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機制研究還不是很清楚?！岸未驌簟睂W說是目前對非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制一種廣泛認可的學說，即首先由于胰島素抵抗等因素導致脂質在肝細胞內異常蓄積，其次肝細胞內異常蓄積的脂質導致肝細胞進一步的損害，非酒精性脂肪性肝炎，肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生。因此，研究非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病過程中的分子機制對于預防NAFLD疾

2、病譜的進展有著重要意義。
　　Rab蛋白屬于小GTP結合蛋白家族中最大的亞家族。Rab蛋白在細胞胞內參與各種膜運輸過程。Rab蛋白家族通過特有的分子開關機制，參與囊泡形成，轉運，黏附，錨著，融合等過程，實現(xiàn)胞內的物質運輸以及膜轉運的功能。由于細胞胞內發(fā)生脂質異常蓄積過程中會有大量的膜活動，因此不難推斷，Rab蛋白可能參與了細胞胞內脂質蓄積的過程并在其中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，已經有多篇文獻報道Rab蛋白參與了多種細胞中脂質蓄積的

3、過程。Rab32作為Rab蛋白中目前唯一與線粒體共定位的Rab蛋白，極有可能參與了胞內的能量代謝過程，目前已有文獻報道Rab32在饑餓狀態(tài)下參與了果蠅中外周脂肪體脂質蓄積的過程，并且能夠改變其脂質蓄積的程度。但是，目前對于Rab32在正常狀態(tài)和能量過剩狀態(tài)下影響細胞胞內的脂質蓄積程度及其可能的分子機制還未有報道。并且，Rab32蛋白在果蠅以及人類中的氨基酸序列有著顯著的種屬差異，其在不同種屬中的功能有可能完全不同。因此，研究Rab32蛋

4、白在肝細胞中對脂質蓄積的影響及其可能機制有助于我們了解非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病分子機制，具有重要的意義。
　　目的:
　　研究Rab32蛋白對肝細胞胞內脂質蓄積的影響及其可能的作用機制
　　方法:
　　1.利用eXact-6xHis蛋白純化系統(tǒng)鑒定分析Rab32蛋白的相互作用蛋白在學校中心實驗室萬瑛主任的幫助下，我們利用profinity eXact蛋白純化標簽，建立Rab32蛋白的eXact-6xHis蛋白串聯(lián)

5、親和純化系統(tǒng)，并且在真核系統(tǒng)里面驗證了eXact-6xHis純化系統(tǒng)的純化效率。我們使用eXact-6xHis蛋白純化系統(tǒng)構建了Hepa1-6plentisEHEGFPRab32細胞系，對細胞中Rab32蛋白進行純化后，利用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳對純化樣品進行分離，并使用硝酸銀染色法驗證了純化效果。結果顯示，eXact-6xHis對Rab32蛋白的純化效果明顯，達到了送測質譜的要求。因此，我們將蛋白純化樣本送測質譜，利用非標定量的

6、方法進行檢測，鑒定分析出了Rab32蛋白可能的相互作用蛋白。
　　2.Rab32蛋白在肝細胞脂質蓄積中的作用機制研究
　　在鑒定分析完Rab32蛋白的相互作用蛋白后，我們推斷出Rab32蛋白極有可能參與了胞內的能量代謝過程。我們使用GEO數(shù)據庫對13例膽囊手術伴有非酒精性脂肪性肝病的病人以及13例膽囊手術不伴有非酒精性脂肪性肝病的病人肝組織中Rab32mRNA水平進行統(tǒng)計，并且我們自己收集6例膽囊手術伴有非酒精性脂肪性肝病的

7、病人以及6例膽囊手術不伴有非酒精性脂肪性肝病的病人的肝組織，QPCR顯示的結果與GEO數(shù)據庫統(tǒng)計結果一致。隨后，我們以OA∶PA=2∶1模擬脂肪酸誘導HepG2和L02細胞，建立了非酒精性脂肪性肝病細胞模型。收集細胞后，我們提取細胞總蛋白檢測Rab32蛋白在臘質蓄積情況下的表達變化，所得結果與前面結果一致。這說明Rab32蛋白在脂質蓄積過程中表達發(fā)生了變化，也提示我們Rab32蛋白在肝細胞脂質蓄積中發(fā)揮了作用。
　　隨后，我們對R

8、ab32蛋白進行了過表達和干擾，檢測了Rab32蛋白在肝細胞脂質蓄積中的作用，并且證明了Rab32蛋白主要通過影響肝細胞胞內脂質水解的過程進而影響胞內脂質蓄積的程度。接著我們使用免疫共沉淀法檢測了Rab32蛋白是否和脂質水解的關鍵酶ATGL存在著相互作用關系，結果顯示Rab32是通過間接作用影響ATGL的表達改變，這符合我們質譜結果中沒有檢測到ATGL蛋白的結果。
　　結論:
　　1).通過eXact-6xHis蛋白純化系統(tǒng)

9、對Rab32蛋白進行純化，并使用非標定量，5次對蛋白樣品進針，Decoy評分篩選高可信度差異蛋白，分析出Rab32蛋白可能的相互作用蛋白有Rab38，PHB1以及PHB2。從功能和定位上說明，Rab32極有可能參與了胞內的能量代謝過程。
　　2).GEO數(shù)據庫，臨床樣本QPCR顯示，非酒精性脂肪性肝病病人肝組織中Rab32mRNA表達水平低于正常對照組。使用HepG2以及L02細胞構建非酒精性脂肪性肝病細胞模型后，Western

10、Blots結果顯示蛋白水平上Rab32蛋白在脂肪酸刺激組中蛋白表達水平同樣下降。過表達以及干擾Rab32蛋白表達后，在四個脂肪酸濃度梯度檢測胞內脂質蓄積水平顯示，敲低Rab32蛋白能夠引起胞內脂質蓄積水平下降。同時，通過對脂質水解關鍵酶ATGL和脂質合成關鍵酶FASN的表達水平進行檢測，我們證實Rab32主要通過影響ATGL的表達水平進而影響胞內的脂質蓄積水平的。隨后，免疫共沉淀實驗顯示Rab32是通過間接作用影響ATGL蛋白的表達改變