枸杞多糖通過SIRT1調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　肝臟不僅是內(nèi)源性和外源性脂質(zhì)代謝途徑的交匯點，而且是維持體內(nèi)脂質(zhì)合成與分解代謝平衡的重要靶器官。高能量飲食攝取不僅誘發(fā)全身性能量代謝途徑失衡，而且引發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，最終導(dǎo)致代謝綜合癥如肥胖、2型糖尿病、高脂血癥及非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）的發(fā)生。近年來，NAFLD呈全球蔓延趨勢，在我國的發(fā)病率也日益上升，并逐漸呈現(xiàn)低年齡態(tài)勢。臨床NAFLD的病

2、理特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪異位沉積，若大量脂肪彌漫性浸潤，則會演變?yōu)榉蔷凭灾靖窝祝╪onalcoholic steatohepatitis,NASH），甚至是肝纖維化或肝硬化。NAFLD的致病基礎(chǔ)是肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的從頭合成途徑（de novo lipogenesis,DNL）逐漸增強，而脂質(zhì)分解及轉(zhuǎn)運途徑相繼減弱，造成甘油三酯大量堆積，從而嚴(yán)重破壞肝細(xì)胞脂代謝平衡。由此可見，肝臟脂質(zhì)代謝失衡是形成脂肪肝的基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段，臨床針對NAFLD

3、的治療仍主要采取適度理療、服用降血脂藥物及肝臟保護劑等，但是藥效甚微，無法達(dá)到根本治療NAFLD的目的。因此，加快研發(fā)針對性治療NAFLD的藥物勢在必行。
　　沉默調(diào)節(jié)因子1（sirtuin1，SIRT1）是一種依賴于NAD+的去乙酰化酶，研究發(fā)現(xiàn)它不僅參與了細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)，而且能夠改善骨骼肌胰島素敏感性、肝細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷。最近報道，SIRT1在NAFLD中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。Sirt1+/-小鼠給予正常飲食后

4、，肝臟中甘油三酯合成增加，同時伴隨脂肪異位沉積。而肝臟SIRT1過表達(dá)可以明顯抑制高脂誘導(dǎo)的脂肪肝癥狀。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以調(diào)節(jié)類固醇類元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding protein1c,SREBP-1c）和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）等與脂質(zhì)合成相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子。在肝細(xì)胞中SIRT1對

5、SREBP-1c去乙?；?，可以顯著抑制SREBP-1c下游脂質(zhì)代謝相關(guān)限速酶和自身的轉(zhuǎn)錄活性，從而極大削弱了甘油三酯DNL途徑。在Sirt1-/-小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞急劇減少，并伴隨PPARγ活性幾乎完全消失。后續(xù)研究者發(fā)現(xiàn)，SIRT1還可以去乙酰化PPARγ共輔因子，阻礙脂肪細(xì)胞分化及成熟。除此之外，SIRT1還可以通過激酶如肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）去乙?；饔冒l(fā)揮代謝通路調(diào)控效應(yīng)。研究證實經(jīng)SIRT

6、1去乙?；腖KB1更容易磷酸化AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）。
　　AMPK晝夜節(jié)律的變化依賴于下丘腦的調(diào)節(jié)，因此AMPK是一種關(guān)鍵的細(xì)胞能量感受器，其生物活性變化受制于AMP/ATP比值調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)，LKB1和Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase,CaMKK）都可以直接磷

7、酸化AMPK?；罨腁MPK可以直接調(diào)節(jié)脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）和激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglayceride lipase,HSL）的表達(dá)，促進脂肪動員。AMPK可以磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACC），導(dǎo)致中間產(chǎn)物丙二酰單酰輔酶A（malonyl-CoA）的減少，解除脂肪酸分解酶-肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移

8、酶-1α（carnitine palmitoyltransferase-1α,CPT-1α）的抑制，加速脂肪酸氧化與利用。上述報導(dǎo)表明，SIRT1/AMPK通路在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著多樣且重要的作用，為NAFLD藥物篩選和機制討論提供了新的思路。
　　現(xiàn)代研究證實，中藥枸杞生物藥理學(xué)作用都與其成熟果實中重要化學(xué)成分枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide,LBP）直接相關(guān)。而LBP由于出色

9、的抗氧化效應(yīng)在抗衰老、抗腫瘤、細(xì)胞調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等多方面有著顯著的功能。本課題前期已經(jīng)報道，LBP通過干預(yù)高脂誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型，明顯減少了全身性及肝臟組織中甘油三酯含量。然而，LBP調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝的具體機制仍不清楚。正如上文所述，肝臟作為脂肪合成、儲存的主要器官，脂肪酸的合成與氧化平衡是脂代謝最重要的機制，LBP如何調(diào)節(jié)關(guān)鍵的能量代謝調(diào)節(jié)分子SIRT1的基因表達(dá)與活性，如何通過SIRT1/AMPK這個重要的信號通路調(diào)節(jié)肝

10、細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝？對于上述問題的回答，將為深入理解枸杞多糖藥用價值提供更加深刻、精細(xì)的理論依據(jù)。
　　研究目的：
　　證實LBP可能通過SIRT1介導(dǎo)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝；證實LBP可以直接調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1表達(dá)及活性；證實LBP可以通過活化SIRT1/AMPK通路改善高脂誘導(dǎo)的NAFLD。
　　研究方法：
　　1.采用不同濃度梯度LBP體外孵育HepG2細(xì)胞24 h，運用NAD+/NADH試劑盒檢測LBP是否

11、增加胞內(nèi)NAD+水平及NAD+/NADH比值；運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)。采用不同濃度LBP與人SIRT1重組蛋白和NAD+底物共孵育1 h，運用SIRT1活性試劑盒檢測LBP是否激活SIRT1去乙?；钚?。采用LBP不同時間孵育HepG2細(xì)胞，運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)。
　　2.采用LBP孵育

12、HepG2細(xì)胞24 h，運用IP檢測LBP是否增加LKB1去乙酰化表達(dá)；運用WB檢測phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)。采用LBP干預(yù)PA處理的HepG2細(xì)胞，運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)；運用油紅O染色及定量分析肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。
　　3.采用LBP干預(yù)SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，運用IP檢測LBP對LKB1

13、去乙酰化效應(yīng)；運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)。采用SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染PA處理的HepG2細(xì)胞后，LBP干預(yù)24 h，運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)；運用酶比色法檢測肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。
　　4.采用不同劑量LBP干預(yù)高脂誘導(dǎo)NAFLD模型12周，檢測飲食、飲水、體重、肝濕重及血清甘油三酯變化，運

14、用H&E和油紅O染色觀察肝組織的脂滴堆積情況；運用酶比色法檢測肝組織內(nèi)甘油三酯含量；運用 ELISA試劑盒檢測血清及肝組織內(nèi)的malonyl-CoA含量；運用qPCR檢測ACC1，F(xiàn)AS，ELOVL6，DGAT及CPT-1α表達(dá)；運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)。
　　5.采用pCDH-SIRT1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正?；騊A處理的HepG2細(xì)胞24 h，運用WB檢測SIRT

15、1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及 FAS表達(dá)。采用SIRT1過表達(dá)慢病毒尾靜脈注射NAFLD小鼠模型，運用H&E和油紅O染色觀察肝組織的脂滴堆積情況；運用酶比色法檢測肝組織內(nèi)甘油三酯含量；運用ELISA試劑盒檢測血清及肝組織內(nèi)的malonyl-CoA含量；運用qPCR檢測ACC1，F(xiàn)AS，ELOVL6，DGAT及CPT-1α表達(dá)；運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，A

16、TGL及FAS表達(dá)。
　　6.采用SIRT1 shRNA慢病毒尾靜脈注射LBP干預(yù)NAFLD模型小鼠，運用H&E和油紅O染色觀察肝組織的脂滴堆積情況；運用酶比色法檢測肝組織內(nèi)甘油三酯含量；運用ELISA試劑盒檢測血清及肝組織內(nèi)的malonyl-CoA含量；運用qPCR檢測ACC1，F(xiàn)AS，ELOVL6，DGAT及CPT-1α表達(dá)；運用WB檢測SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC，ATGL及FAS表達(dá)。

17、>　　研究結(jié)果：
　　1.LBP以濃度或時間依賴性增加SIRT1表達(dá)
　　0-900μg/mL LBP分別孵育HepG2細(xì)胞24 h，LBP以濃度依賴性增加SIRT1蛋白表達(dá)；600μg/mL LBP以0 h，6 h，12 h，24 h，48 h分別孵育HepG2細(xì)胞，LBP以時間依賴性增加SIRT1蛋白表達(dá)。
　　2.LBP上調(diào)NAD+/NADH比值及增加SIRT1去乙?；钚?br>　　300和600μg/mL L

18、BP分別孵育HepG2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)LBP以濃度依賴性增加了NAD+水平及NAD+/NADH比值；100-600μg/mLLBP分別與人重組蛋白和NAD+底物共孵育1 h，發(fā)現(xiàn)LBP以濃度依賴性上調(diào)了SIRT1去乙?；钚浴?br>　　3.LBP通過SIRT1增加了LKB1去乙?；磉_(dá)和AMPK磷酸化表達(dá)
　　600μg/mL LBP孵育HepG2細(xì)胞24 h，通過IP實驗顯示LBP增加LKB1的去乙?；磉_(dá)。0-900μg/

19、mL LBP分別孵育HepG2細(xì)胞24 h，WB顯示LBP明顯呈濃度依賴性增加phospho-AMPK和phospho-ACC的表達(dá)。250μM PA處理HepG2細(xì)胞12 h后，600μg/mLLBP干預(yù)0 h，6 h，12 h，24 h，48 h，WB結(jié)果顯示，LBP呈時間依賴性增加phospho-AMPK和phospho-ACC的表達(dá)。
　　4.LBP調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成與分解代謝
　　0-900μg/mL LBP分別孵

20、育HepG2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)LBP呈濃度依賴性減少了肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴堆積，同時增加ATGL表達(dá)和減少FAS表達(dá)。250μM PA處理HepG2細(xì)胞12 h后，0-900μg/mL LBP干預(yù)24 h，WB結(jié)果顯示LBP依舊可以增加ATGL表達(dá)、減少FAS表達(dá)。
　　5.LBP可在體內(nèi)通過SIRT1/AMPK通路緩解NAFLD
　　100和200 mg/kg LBP干預(yù)高脂喂養(yǎng)小鼠12周，LBP明顯降低小鼠體重及肝濕重；肝臟形

21、態(tài)及染色顯示，LBP明顯減少了肝臟內(nèi)脂滴形成；血清及肝組織甘油三酯測定提示，LBP可以改善高脂誘導(dǎo)的血脂異常；肝組織WB顯示，LBP增加了SIRT1，phospho-AMPK，phospho-ACC和ATGL表達(dá)、減少FAS表達(dá)；ELISA實驗顯示，LBP可以明顯降低ACC作用產(chǎn)物malonyl-CoA含量累積；qPCR結(jié)果顯示，LBP明顯抑制脂質(zhì)合成酶表達(dá)，而促進脂肪酸氧化酶的表達(dá)。此外，LBP還可以改善小鼠血脂異常和耐量實驗。

22、>　　6.SIRT1過表達(dá)減少肝細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯合成
　　通過體外SIRT1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染及體內(nèi)尾靜脈注射SIRT1慢病毒，我們發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)可以明顯改善肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝，從而緩解高脂誘導(dǎo)的NAFLD。
　　7.SIRT1 shRNA拮抗LBP調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的效應(yīng)
　　SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染PA處理的HepG2細(xì)胞并給予LBP干預(yù)24 h，WB和甘油三酯測定結(jié)果顯示，SIRT1 siRNA可以扭轉(zhuǎn)LBP的降脂效應(yīng)。

23、LBP干預(yù)的高脂喂養(yǎng)小鼠模型尾靜脈注射SIRT1 shRNA慢病毒，繼續(xù)喂養(yǎng)7天。通過H&E、油紅O染色及甘油三酯含量測定等實驗，SIRT1 shRNA明顯抑制了LBP的減脂效應(yīng)；WB和qPCR結(jié)果顯示，SIRT1 shRNA抑制了SIRT1/AMPK信號通路的開放，誘導(dǎo)malonyl-CoA含量增加，加重動物血脂紊亂。
　　研究結(jié)論：
　　1.證實LBP可以增加肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)與活性。
　　2.證實LBP可