SIRT1調(diào)控Wnt信號通路影響間充質(zhì)干細胞成脂定向的機制.pdf

1、動物脂肪組織的沉積不僅僅是增加已存在的脂肪細胞中的脂類儲藏，而且始終伴隨著從祖細胞生成新的脂肪細胞的過程，即“脂肪生成(adipogenesis)”。脂肪生成包括起始階段多能干細胞向前脂肪細胞“定型”，以及隨后前脂肪細胞向成熟脂肪細胞“分化”。在過去的二十年中，人們對調(diào)控脂肪生成的調(diào)網(wǎng)絡，特別是控制前脂肪細胞向脂肪細胞“分化”的轉錄級聯(lián)已經(jīng)基本清楚。而在“定型”階段，雖然目前已有一些轉錄因子和信號通路也陸續(xù)被證實，但由于缺少前脂肪細胞的

2、標志基因，因此，多能的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)向前脂肪細胞“定型”的特異性定型因子及其分子機制有待進一步研究。
　　已有研究證實，SIRT1在前脂肪細胞分化中，不僅可以去乙?；M蛋白，調(diào)控轉錄因子的轉錄活性;而且可以去乙?；旧申P鍵轉錄因子。此外，在MSCs細胞命運決定中，SIRT1可以促進MSCs的成骨分化，而抑制MSCs的成脂分化。但SIRT1調(diào)控MSCs成脂定向的分子機制尚不明確

3、，有待進一步闡明。
　　本研究由兩部分組成，第一部分為體外細胞實驗，研究SIRT1通過Wnt信號通路的對MSCs細胞成脂定向的影響，并闡明SIRT1通過調(diào)控Wnt信號通路，影響MSCs分化形成脂肪細胞的分子機制。第二部分為體內(nèi)活體試驗，以SIRT1敲除的小鼠為研究對象，通過動物活體驗證SIRT1與脂肪形成的關系;同時以分離的小鼠的胚胎成纖維細胞（mouseembryonicfibroblasts，MEFs）為材料，進一步探討了SI

4、RT1調(diào)控MSCs成脂定向的分子機制。主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　第一部分，體外細胞實驗。在C3H10T1/2細胞中，對SIRT1用激活劑或抑制劑處理，或干涉/過表達SIRT1后，研究SIRT1對脂肪生成表型及成脂標志基因mRNA和蛋白水平的影響。在此基礎上，研究干涉SIRT1對Wnt信號靶基因和關鍵蛋白的表達及Wnt信號通路報告系統(tǒng)活性的影響;用Real-timePCR芯片篩選出受SIRT1調(diào)控Wnt信號通路拮抗物;并穩(wěn)定干涉

5、這些Wnt信號通路拮抗物后，研究對成脂表型及成脂標志基因mRNA和蛋白水平的影響;通過ChIP和IP等手段，研究SIRT1調(diào)控Wnt信號通路的分子機制。主要結果如下:
　　1.添加SIRT1的激活劑白藜蘆醇抑制了C3H10T1/2細胞的成脂表型，且成脂標志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達也顯著抑制;而添加SIRT1的抑制劑煙酰胺則促進了C3H10T1/2細胞的脂滴形成，成脂標志基因(PPARγ

6、，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達豐度顯著上調(diào)(P＜0.05)。白藜蘆醇處理顯著增加了6h和12h的S期細胞數(shù)量（P＜0.05），煙酰胺處理對細胞周期影響不顯著(P＞0.05)。
　　2.在C3H10T1/2細胞中干涉SIRT1，成脂誘導后，增加了油紅O染色的脂滴的數(shù)目，且顯著提高了成脂標志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達豐度;而過表達SIRT1組，視野中油紅O染色的脂滴較

7、少，顯著抑制了成脂標志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達。表明激活SIRT1抑制了MSCs細胞的成脂定向;而抑制SIRT1的活性，則促進了MSCs細胞的成脂定向。
　　3.在C3H10T1/2細胞中干涉SIRT1，顯著抑制了Wnt信號通路靶基因CyclinD1的mRNA和蛋白表達水平(P＜0.05)以及Wnt信號通路關鍵分子β-catenin的蛋白水平;Wnt信號通路報告系統(tǒng)實驗結果顯示，干涉S

8、IRT1顯著抑制了Wnt信號通路報告系統(tǒng)的活性(P＜0.05);此外，通過轉染β-catenin的突變體質(zhì)粒，結果發(fā)現(xiàn)SIRT1對Wnt信號通路的調(diào)控是依賴β-catenin的。
　　4.Wnt信號PCR芯片結果及對芯片的驗證結果顯示，激活SIRT1顯著抑制了Wnt信號通路胞外拮抗物sFRP1和sFRP2以及胞內(nèi)拮抗物Dact1的mRNA表達水平(P＜0.05);而抑制SIRT1顯著提高了Wnt信號通路胞外拮抗物sFRP1和sFR

9、P2以及胞內(nèi)拮抗物Dact1的mRNA表達水平(P＜0.05)。這表明，SIRT1對Wnt信號通路的調(diào)控可能是通過Wnt信號的胞外拮抗物sFRP1和sFRP2，以及Wnt信號的胞內(nèi)拮抗物Dact1來實現(xiàn)的。
　　5.分別建立穩(wěn)轉干涉SIRT1和干涉Wnt信號通路拮抗物的細胞材料:pLKO.1-SIRT1、pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP1、pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP2,pLKO.1-SIRT1

10、+pLKO.1-Dact和pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP1+pLKO.1-sFRP2;成脂誘導這些穩(wěn)轉的細胞，結果顯示與pLKO.1-SIRT1組相比，這些細胞的形成的脂滴較少，且成脂標志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白的表達下調(diào);Wnt信號通路報告系統(tǒng)實驗結果顯示，與pLKO.1-SIRT1組相比，提高了Wnt信號通路的活性。以上結果表明，在MSCs細胞成脂定向過程中，SIRT1可能

11、通過Wnt信號拮抗物sFRP1、sFRP2和Dact1來作用的。
　　6.ChIP結果顯示，干涉SIRT1顯著增加了sFRP1、sFRP2和Dact1的啟動子區(qū)域的組蛋白的H3K9和H4K16的乙?；?P＜0.05)。此外，IP結果顯示，干涉SIRT1顯著增加了β-catenin的乙酰化水平，且減少了β-catenin進入細胞核內(nèi)的水平。這表明，SIRT1可以通過去乙?；M蛋白和非組蛋白兩種方式調(diào)控Wnt信號通路。
　　

12、第二部分，體內(nèi)活體實驗。首先，以SIRT1單敲的小鼠（SIRT1+/-）為研究對象，SIRT1野生型小鼠（SIRT1+/+）為對照，驗證SIRT1與脂肪形成的關系。正常飲食飼喂12w后，對小鼠稱重并取樣，對各部位脂肪組織和肝臟稱重，并計算脂肪組織與體重的比值;檢測血液中甘油三酯的含量;通過外觀和HE染色觀察脂肪組織的形態(tài);并檢測了皮下和內(nèi)臟脂肪組織中成脂標志基因的變化。然后，分離13.5的小鼠胚胎的MEFs細胞，經(jīng)基因型鑒定后，對不同S

13、IRT1基因型（SIRT1+/+、SIRT1+/-和SIRT1-/-）的MEFs細胞成脂誘導，研究SIRT1對脂肪生成表型及成脂標志基因mRNA和蛋白水平的影響;此外，以不同SIRT1基因型的MEFs細胞為材料，通過ChIP和IP等手段進一步探討SIRT1調(diào)控Wnt信號通路的分子機制。主要結果如下:
　　1.小鼠正常飲食飼喂12w后，SIRT1+/-小鼠的外觀正常，但體重顯著低于SIRT1+/+小鼠(P＜0.05);脂肪組織和肝臟

14、質(zhì)量沒有顯著差異(P＞0.05)，但提高了SIRT1+/-小鼠的脂肪與體重質(zhì)量比(P＜0.05);血液中甘油三酯的含量也沒有顯著差異(P＞0.05)。以上結果表明，SIRT1敲除影響了小鼠生長，但并不影響脂肪組織和肝臟組織的發(fā)育，相反可以促進脂肪的形成。
　　2.對脂肪組織的形態(tài)研究結果顯示，不同基因型小鼠的棕色脂肪組織和附睪脂肪組織外觀差異不顯著;HE染色結果顯示，SIRT1+/-小鼠脂肪組織脂肪細胞的體積有增加的趨勢。

15、　　3.SIRT1+/-小鼠顯著提高了皮下脂肪（腹股溝脂肪）中PPARγ的mRNA表達豐度(P＜0.05)，對內(nèi)臟脂肪（附睪脂肪）中PPARγ的mRNA表達沒有顯著差異（P＞0.05）;aP2和adiponectin的mRNA在兩種基因型小鼠的皮下和內(nèi)臟脂肪組織中的表達也沒有差異。
　　4.成脂誘導MEFs細胞后，SIRT1+/-和SIRT1-/-組的MEFs細胞脂滴數(shù)目較多，而SIRT1+/-組最多;SIRT1+/-組的成脂標志

16、基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的表達豐度極顯著或顯著高于SIRT1+/+和SIRT1-/-組(P＜0.01;P＜0.05);而SIRT1-/-組的成脂標志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的表達豐度極顯著高于SIRT1+/+(P＜0.01)。以上結果表明，SIRT1缺失則促進了MEFs細胞的脂肪生成，SIRT1單缺失具有更強的成脂能力。
　　5.ChIP結果顯示，在SIRT1缺失的MEFs細胞中

17、，顯著增加了sFRP1、sFRP2和Dact1的啟動子區(qū)域的組蛋白的H3K9和H4K16的乙?；?P＜0.05)。IP結果顯示，干涉SIRT1缺失增加了β-catenin的乙?；?。這表明在SIRT1缺失的MEFs細胞中，SIRT1也可以通過去乙?；M蛋白和非組蛋白兩種方式調(diào)控Wnt信號路。
　　本研究的主要結論:
　　SIRT1對間充質(zhì)干細胞命運選擇具有決定性作用，激活SIRT1抑制了MSCs細胞的成脂定向，而抑制S