SIRT1在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 SIRT1去乙?；概c細(xì)胞的核仁應(yīng)激反應(yīng)
　　本研究的目包括以下兩方面:(1)明確核仁應(yīng)激反應(yīng)是否存在于血管細(xì)胞中，以及核仁應(yīng)激反應(yīng)是否對(duì)不同的刺激存在特異性;(2)探討SIRT1對(duì)細(xì)胞核仁應(yīng)激的作用和機(jī)制，明確SIRT1-核仁應(yīng)激途徑是否可以為SIRT1介導(dǎo)的不依賴乙?；饔玫腜53穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制提供一個(gè)合理的解釋。
　　一、血管細(xì)胞中的核仁應(yīng)激反應(yīng)
　　目的：

2、>　　1.研究不同應(yīng)激刺激（ACTD，H2O2，熱休克，血清饑餓和氨基酸饑餓）對(duì)于Hela細(xì)胞核仁應(yīng)激的影響。
　　2.研究在不同的應(yīng)激刺激下血管細(xì)胞(HUVEC，HSMC)能否發(fā)生核仁應(yīng)激。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):Hela細(xì)胞用高糖DMEM（含10％胎牛血清+1％青霉素/鏈霉素）貼壁培養(yǎng)。
　　2.核仁應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè):用ACTD(5nM)刺激Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC6、12、24小時(shí);用H2O2

3、刺激Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC，分別設(shè)計(jì)濃度梯度(0，10μM，30μM，60μM，100μM，300μM，600μM，1200μM)和時(shí)間梯度(0，2、4、8、12小時(shí))，以確定應(yīng)激反應(yīng)最佳濃度和時(shí)間。
　　結(jié)果：
　　1.ACTD刺激能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。
　　2.H2O2刺激能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。
　　3.血清饑餓不影響Hela

4、細(xì)胞核仁形態(tài)，血清饑餓可以誘導(dǎo)HUVEC和HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。
　　4.氨基酸饑餓能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。
　　5.熱休克能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。
　　6.ACTD和H2O2刺激都能降低Hela細(xì)胞pre-rRNA表達(dá)水平。
　　7.ACTD刺激促進(jìn)Hela細(xì)胞P53蛋白的富集。
　　結(jié)論：
　　1.在應(yīng)激刺激情況下血管細(xì)胞中(

5、HUVEC，HSMC)的確存在核仁應(yīng)激的現(xiàn)象。
　　2.雖然不同細(xì)胞發(fā)生核仁應(yīng)激的刺激條件可能存在差異，我們的結(jié)果支持核仁應(yīng)激是細(xì)胞應(yīng)激條件下的一個(gè)普遍反應(yīng)，對(duì)不同刺激條件的特異性不明顯。
　　二、SIRT1對(duì)細(xì)胞核仁應(yīng)激反應(yīng)的作用
　　目的：
　　明確SIRT1能否影響不同刺激引起的核仁應(yīng)激反應(yīng)
　　方法：
　　1.為了闡明SIRT1能否干預(yù)核仁應(yīng)激的發(fā)生，本研究采用了四種方法改變Hela細(xì)胞SIR

6、T1的水平。
　　2.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)Western blotting檢測(cè):提取Hela細(xì)胞蛋白，檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.下調(diào)SIRT1的水平促進(jìn)核仁應(yīng)激的發(fā)生
　　2.上調(diào)SIRT1的水平抑制核仁應(yīng)激的發(fā)生
　　結(jié)論：
　　SIRT1是核仁應(yīng)激的負(fù)調(diào)控因子，抑制細(xì)胞核仁應(yīng)激的發(fā)生。
　　三、SIRT1改善核仁應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制
　　目的:
　　1.探討SIRT1調(diào)

7、節(jié)核仁應(yīng)激的生物學(xué)機(jī)制
　　2.研究SIRT1與核仁之間的關(guān)系，SIRT1與核仁蛋白NPM是否共定位
　　3.研究SIRT1是否去乙?；疦PM，探討SIRT1與核仁蛋白NPM的關(guān)系。
　　方法:
　　1.細(xì)胞核仁的分離與鑒定:SIRT1抑制劑EX-527處理24小時(shí)的Hela細(xì)胞經(jīng)低滲裂解分離細(xì)胞核，相差顯微鏡觀察下，密度梯度離心分離細(xì)胞核仁，westernblot檢測(cè)核仁marker-NPM，NS，F(xiàn)ibril

8、larin;核質(zhì)marker-Histone H3;細(xì)胞質(zhì)marker-GAPDH，以驗(yàn)證提取核仁的純度。
　　2.分析SILAC-蛋白組學(xué)。
　　3.免疫共沉淀:Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1-Flag質(zhì)粒，提取蛋白，免疫共沉淀法檢測(cè)外源性的SIRT1與NPM是否結(jié)合。
　　4.Western Blot:標(biāo)簽Flag，AC-lysine，β-Actin蛋白表達(dá)。Hela細(xì)胞EX-527處理24小時(shí)后，后提取蛋白，檢測(cè)NP

9、M，AC-lysine，β-Actin蛋白表達(dá)。
　　5.免疫熒光法觀察SIRT1在Hela細(xì)胞中的分布，檢測(cè)SIRT1與核仁蛋白NPM是否共定位。
　　6.為了研究SIRT1抑制核仁應(yīng)激的作用是否依賴于它去乙酰化酶的活性，本研究采用了三種方法改變SIRT1的活性。
　　7.NPM-pGEX質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化。
　　8.NPM-GST融合蛋白的大量表達(dá)和純化。
　　9.進(jìn)行體外乙?；腿ヒ阴；瘜?shí)驗(yàn)
　　

10、結(jié)果:
　　1.SIRT1與核仁標(biāo)記性蛋白NPM相結(jié)合。
　　2.SIRT1在提取的Hela細(xì)胞核仁中部分表達(dá)。
　　3.SIRT1抑制核仁應(yīng)激的作用只部分依賴于它去乙?；傅幕钚?。
　　4.SIRT1沒有顯著影響Hela細(xì)胞的NPM乙?；?br>　　5.SIRT1能上調(diào)NPM蛋白水平。
　　結(jié)論：
　　1.SIRT1在Hela細(xì)胞核仁中表達(dá)，與核仁蛋白NPM相結(jié)合
　　2.與NPM結(jié)合的是S

11、IRT1蛋白的中間段，不與NPM結(jié)合后，SIRT1喪失了對(duì)核仁的保護(hù)作用。
　　3.SIRT1抑制Hela細(xì)胞核仁應(yīng)激只部分依賴于其去乙酰化酶的作用。
　　4.SIRT1介導(dǎo)的NPM去乙?；谝种坪巳蕬?yīng)激反應(yīng)中可能不起決定性作用。
　　四、SIRT1可能通過非去乙?；臋C(jī)制調(diào)節(jié)P53富集
　　目的:
　　1.研究SIRT1對(duì)核仁應(yīng)激發(fā)生時(shí)P53表達(dá)的影響。
　　2.探討SIRT1影響細(xì)胞P53富集的機(jī)

12、制。
　　方法:
　　1.免疫熒光法檢測(cè)P53表達(dá):PBS清洗細(xì)胞，冰甲醇4℃固定，1％BSA封閉，一抗（1％BSA配置）4℃孵育過夜，二抗（1％BSA配置）避光常溫孵育1小時(shí)，DAPI細(xì)胞核染色，抗熒光淬滅分片劑封片。
　　2.Western blot法檢測(cè)P53表達(dá)。
　　3.構(gòu)建P53突變質(zhì)粒。
　　結(jié)果:
　　Hela細(xì)胞核仁應(yīng)激的發(fā)生早于P53的積累。
　　用ACTD刺激Hela細(xì)胞，

13、設(shè)計(jì)時(shí)間曲線0，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時(shí)，核仁應(yīng)激最早發(fā)生在4小時(shí)，而Western blot顯示P53積累大約發(fā)生在22小時(shí)；免疫熒光和WB方法發(fā)現(xiàn)，ACTD刺激Hela細(xì)胞能引起P53蛋白水平增加，過表達(dá)SIRT1能明顯降低P53的富集；SIRT1能通過不依賴于去乙?；饔谜{(diào)節(jié)P53富集。
　　結(jié)論:
　　SIRT1抑制核仁應(yīng)激引起的P53富集，這個(gè)過程可能不依賴于SIRT1去乙

14、酰化作用。
　　五、心血管疾病中的核仁應(yīng)激現(xiàn)象
　　目的:
　　探討在心血管疾病的動(dòng)物模型上是否存在核仁應(yīng)激現(xiàn)象。
　　方法:
　　1.構(gòu)建心肌肥厚動(dòng)物模型。
　　2.心肌肥厚動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。
　　3.組織免疫熒光檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。
　　結(jié)論:
　　心肌肥厚失代償期的小鼠心肌發(fā)生核仁應(yīng)激。
　　第二部分 SIRT1去乙酰

15、化酶在剪切力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　目的：
　　1.研究剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響。
　　2.探討SIRT1在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)中的作用及生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建體外剪切力模型。
　　2.檢測(cè)自噬功能。
　　3.免疫共沉淀法檢測(cè)層流處理后自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7、FoxO的乙?；?。
　　4.應(yīng)用Amplex red熒光法檢測(cè)NADPH氧化酶抑制劑對(duì)層流處理后H

16、UVECROS水平的影響。
　　5.應(yīng)用Caspase3/7試劑盒檢測(cè)在層流剪切力干預(yù)，或者應(yīng)用各種自噬抑制劑時(shí)下HUVEC的凋亡情況。
　　6.構(gòu)建帶有SIRT1熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)層流后SIRT1基因啟動(dòng)子的活性。
　　結(jié)果：
　　免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理狀況下的層流剪切力誘導(dǎo)促進(jìn)自噬，而低剪切力和振蕩剪切力不促進(jìn)自噬；時(shí)程分析和層流停止實(shí)驗(yàn)證實(shí)，層流剪切力引起的

17、自噬反應(yīng)并不是一個(gè)短暫的適應(yīng)壓力反應(yīng)，而是一個(gè)持續(xù)的生理作用；氨基酸饑餓引起HUVEC自噬反應(yīng)的發(fā)生，類似層流剪切力引起的自噬，可以用作陽性對(duì)照；層流剪切力增加P62的轉(zhuǎn)錄，但沒有改變P62的蛋白水平；自噬抑制劑氯喹顯著增加HUVEC LC3的含量；自噬后期的抑制劑BafilomycinA1既能增加基礎(chǔ)狀況下HUVEC LC3的含量，又能增加層流剪切力后HUVEC LC3的含量；層流剪切力不改變HUVEC mTOR的磷酸化水平；層流剪切

18、力增強(qiáng)HUVEC基因啟動(dòng)子的活性；SIRT1去乙?；傅幕钚栽谄湔{(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的過程中起重要作用；層流剪切力內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)是氧化還原依賴的；SIRT1依賴的FoxO1激活在層流剪切力介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)中是至關(guān)重要的；層流剪切力降低自噬相關(guān)蛋白ATG5和ATG7的乙酰化水平；自噬反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　層流剪切力通過氧化還原反應(yīng)和依賴SIRT1的機(jī)制促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬。內(nèi)皮細(xì)胞中剪切力誘導(dǎo)的自噬可能是層流血