SIRT1在氫醌誘發(fā)人淋巴母細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、[目的]：
　　1.研究沉默信息調(diào)節(jié)子1(silent information regulator1，SIRT1)在氫醌(hydroquinone，HQ)短期處理人淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞后所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)及其與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)變化的聯(lián)系。
　　2.探討SIRT1在HQ長期誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用。
　　[方法]：
　　1.應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建TK6細(xì)胞的SIRT1缺陷細(xì)胞株(TK6-shSIRT1)

2、，并用實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time ploymerasechain reaction，qRT-PCR)和免疫印跡法(western blotting，WB)聯(lián)合鑒定干擾效果，比較兩種細(xì)胞的一般生物學(xué)特性（細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期分布）。
　　2.用不同劑量HQ分別染毒TK6和TK6-shSIRT1細(xì)胞48 h，以磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS

3、)為溶劑對照組。檢測并比較兩種細(xì)胞存活率、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況。
　　3.用20.0μM HQ染毒TK6細(xì)胞24 h，每周一次，通過生長速度、侵襲能力和裸鼠皮下成瘤能力鑒定細(xì)胞的惡性表型;瘤塊常規(guī)病理切片HE染色檢查，并用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織中K-ras、P53、PARP-1和SIRT1的表達(dá)情況。
　　4.用qRT-PCR和WB分別檢測SIRT1，PARP-1，Bcl-2，P53，K-ras和乙?；M蛋白3(

4、acH3)在HQ短期處理的細(xì)胞和長期誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中mRNA或（和）蛋白水平的表達(dá)情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x)±s表示，組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn);P≤0.05時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)果]：
　　1.成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)的人淋巴母細(xì)胞SIRT1缺陷細(xì)胞

5、株;與TK6正常細(xì)胞株相比，TK6-shSIRT1細(xì)胞中SIRT1基因在mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降了84.6％和94.5％，且生長速度加快了6.57 h，增殖指數(shù)增加了11.8％，但細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)明顯改變。
　　2.經(jīng)HQ短時間處理后:兩種細(xì)胞存活率均呈劑量依賴性降低;相同染毒劑量條件下，TK6-shSIRT1細(xì)胞的存活率均明顯低于TK6細(xì)胞。與PBS對照組相比，HQ處理48 h后，TK6細(xì)胞在10、20和40μM HQ處理時

6、發(fā)生G1期阻滯;與PBS對照組相比，TK6-shSIRT1細(xì)胞在20μM HQ處理時發(fā)生S期阻滯，40μMHQ處理時發(fā)生G1期阻滯。與TK6正常細(xì)胞株相比，TK6-shSIRT1細(xì)胞在10、20和40μM HQ處理時，G1期細(xì)胞比例減少，而S期細(xì)胞比例顯著增加。每個劑量HQ處理時，TK6-shSIRT1細(xì)胞比TK6細(xì)胞早期凋亡率高。正常TK6細(xì)胞中sirt1、p53和k-ras基因表達(dá)下調(diào)，parp-1和bcl-2表達(dá)量未見顯著變化;T

7、K6-shSIRT1細(xì)胞中parp-1基因下調(diào)，bcl-2、p53和k-ras基因表達(dá)上調(diào)。
　　3.TK6細(xì)胞經(jīng)HQ誘導(dǎo)19周后生長速度是對照組的1.82倍，金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，mmp-9) mRNA水平表達(dá)量是對照組的13.11倍，并且HQ轉(zhuǎn)化細(xì)胞在裸鼠皮下接種后形成腫瘤。瘤塊病理切片HE染色:移植瘤細(xì)胞密集，呈實(shí)性團(tuán)塊、巢狀或索條狀排列，間隔以少量間質(zhì)，可見腫瘤血管;細(xì)胞

8、核大深染，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出深淺不同的紅色。免疫組織化學(xué)檢測出人K-ras、P53、PARP-1和SIRT1蛋白陽性細(xì)胞比例分別為67.8％，11.8％，43.2％和15.1％。
　　4.HQ誘發(fā)TK6細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，SIRT1和K-ras表達(dá)顯著上調(diào)，Caspase-3、P53和acH3水平降低，PARP-1表達(dá)量變化不明顯。
　　[結(jié)論]：
　　1.成功構(gòu)建穩(wěn)定的人淋巴母細(xì)胞SIRT1缺陷細(xì)胞株。
　　2.SI