SIRT1在調(diào)控腸上皮屏障損傷中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸粘膜屏障是機體抵御外界病原侵襲的重要屏障結(jié)構(gòu),包括機械屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障。腸黏膜機械屏障是由不斷的更新的上皮細胞以及細胞之間的緊密連接構(gòu)成的物理屏障,將上皮下的組織和腸道菌群隔離開,防止細菌的侵襲及隨后引起的炎癥,因此機械屏障是腸粘膜屏障結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。上皮細胞快速的更新,替代脫落的腸上皮細胞,維持著腸上皮屏障的完整性[1]。腸黏膜具有獨特的解剖結(jié)構(gòu),從血管、上皮下組織、腸粘膜上皮細胞到腸腔形成了明

2、顯的由高到低的氧濃度梯度[2]。炎癥性腸病(IBD)、全胃腸外營養(yǎng)(TPN)、缺血再灌注(I/R)、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷和手術(shù)應(yīng)激等病理條件下,均可引起腸黏膜局部缺血缺氧,進而破壞緊密連接蛋白及釋放大量炎性因子,導致腸道通透性增加,內(nèi)毒素入血及細菌移位(bacteria translocation,BT),進而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),并最終誘發(fā)多臟器功能衰竭(MODS),甚至導致患者死亡[3]。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIR

3、T1)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙?；?histone deacetylase,HDAC),在維持穩(wěn)態(tài)以及細胞生存中起關(guān)鍵作用[4]。SIRT1是第III類組蛋白去乙?；竤irtuin蛋白家族中的一員[5]。位于細胞核中的SIRT1蛋白是研究的最多的去乙?；?負性調(diào)節(jié)損傷反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和p53,從而促進細胞在壓力下生存[6][7][8]。研究發(fā)現(xiàn),缺血缺氧等應(yīng)急情況下,SIRT1的激動劑Resveratrol

4、的預處理可使心臟、腦及腎臟等組織器官損傷減輕[9][10][11]。大量研究證明,SIRT1在慢性炎癥性損傷過程中,通過減少炎性因子的釋放,以及抑制炎性因子介導的細胞毒性反應(yīng),發(fā)揮著保護作用[1][2][3]。Singh等[4]發(fā)現(xiàn),在葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎模型中,Resveratrol可以降低IL-6和IL-1β等炎癥因子表達,減輕炎癥對腸黏膜造成的損傷。
　　對于SIRT1的在急、慢性病理條件中如何參與調(diào)控腸粘膜屏障功能

5、的研究,目前仍不明確。因此,本課題擬建立體外腸上皮屏障模型,應(yīng)用RT-PCR、蛋白印跡、免疫熒光、跨上皮電阻測定等技術(shù),探討缺氧條件以及TNF-α條件下SIRT1的激活對維持腸上皮屏障功能關(guān)鍵的分子Claudin-1、Occludin、ZO-1等的表達及結(jié)構(gòu)的變化。并通過跨上皮電阻技術(shù)測定跨上皮電阻(TER),明確缺氧條件下SIRT1的激活對腸上皮屏障的調(diào)控機制,為腸上皮屏障損傷及修復機制研究的提供新思路。
　　方法:
　　

6、1.體外建立腸上皮細胞缺氧模型及SIRT1激動劑Resveratrol處理模型,通過跨上皮電阻(TER)測定技術(shù),了解缺氧及Resveratrol(SIRT1激動劑)干預情況下TER的變化情況。通過蛋白印跡、RT-PCR、免疫熒光,檢測常氧、缺氧及缺氧條件下Resveratrol干預對腸上皮Claudin-1、Occludin、ZO-1表達以及結(jié)構(gòu)的影響。
　　2.在上述細胞模型中,通過蛋白印跡WB技術(shù)檢測NF-κB在各實驗組的表

7、達變化,探討SIRT1在缺氧條件下腸上皮屏障功能調(diào)節(jié)可能的作用機制及信號通路。
　　3.模型建立腸上皮細胞系Caco-2 TNF-α處理及SIRT1激動劑Resveratrol干預模型,通過transwell小室培養(yǎng)腸上皮細胞、TER測定技術(shù),了解TNF-α處理及Resveratrol(SIRT1激動劑)干預情況下TER的變化情況。通過蛋白印跡、免疫熒光,檢測對照、TNF-α處理及TNF-α處理+Resveratrol干預對腸上皮

8、Occludin、ZO-1表達以及結(jié)構(gòu)的影響。
　　主要結(jié)果:
　　1.單純?nèi)毖蹩梢詫е麦w外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細胞SIRT1表達量減少;缺氧引起緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA及蛋白表達水平下降,并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞,同時上皮細胞TER明顯降低;而SIRT1激動劑Resveratrol緩解了缺氧條件引起的腸上皮屏障功能損害,腸上皮細胞緊密連接蛋白表達增多,且促進跨上皮電阻TER恢復。<

9、br>　　2.缺氧6h后,Caco-2腸上皮細胞質(zhì)內(nèi)的p-IκB表達與對照組相比明顯增加,而I-κB則減少;細胞質(zhì)內(nèi)的p65表達明顯降低,同時細胞核內(nèi)的p65表達明顯增加。這表明p65從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了細胞核,是NF-κB活化的表現(xiàn),而SIRT1被Resveratrol激活后則能明顯抑制這一活化作用。
　　3.TNF-α處理可以導致體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細胞SIRT1表達量減少;TNF-α處理引起緊密連接蛋白Occludin和Z

10、O-1蛋白表達水平下降,并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞,同時上皮細胞TER明顯降低;而SIRT1激動劑Resveratrol預處理緩解了TNF-α處理引起的腸上皮屏障功能損害,腸上皮細胞的緊密連接蛋白表達增多,且促進了跨上皮電阻恢復。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧及TNF-α處理條件下腸上皮SIRT1表達明顯降低,TJs表達降低,結(jié)構(gòu)破壞,同時造成腸上皮細胞 TER降低。而Resveratrol的預處理則可緩解這一作用。提示缺氧及TNF-