腸缺血再灌注條件下IFN-γ通過調(diào)控HIF-1α在腸上皮屏障功能損害中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的
　　腸粘膜屏障是機(jī)體抵御外界侵襲的的重要屏障。大量研究表明:戰(zhàn)創(chuàng)傷、燒傷、大型手術(shù)等外科應(yīng)激及炎性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)、全胃腸外營養(yǎng)(totalparenteralnutrition，TPN)等慢性病理刺激均可導(dǎo)致腸粘膜屏障損傷，造成腸源性感染，進(jìn)一步加重原發(fā)疾病，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，導(dǎo)致多臟器功能衰竭(MODs)[1]。盡管目前研究針對(duì)多種急、慢性病理?xiàng)l件下

2、腸粘膜屏障功能調(diào)控機(jī)制做了大量研究工作，但不同病理?xiàng)l件下腸粘膜屏障損傷與修復(fù)機(jī)制仍未闡明。
　　近年來研究已經(jīng)表明，腸粘膜局部缺氧可能是多種病理?xiàng)l件下腸粘膜屏障功能失衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)在多種急、慢性病例刺激下，如:感染、膿毒血癥、休克、手術(shù)及創(chuàng)傷等引起的缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷、炎性腸病等，均會(huì)引起腸粘膜的局部缺氧，而這種缺氧與腸粘膜獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。腸腔內(nèi)一般氧含量低下

3、，內(nèi)含大量消化的食物、厭氧菌等，在腸粘膜屏障功能發(fā)揮中擔(dān)負(fù)重要角色的腸上皮細(xì)胞層直接面對(duì)著腸腔的低氧環(huán)境，而在上皮細(xì)胞層之下是氧含量較為豐富的彌漫的網(wǎng)狀血管，這樣從腸腔、腸上皮、上皮下組織到粘膜血管逐漸形成了由低至高的氧濃度梯度，同時(shí)粘膜缺氧與炎癥反應(yīng)會(huì)協(xié)同作用，大量炎癥因子會(huì)加劇缺氧造成的腸粘膜屏障功能損傷。隨著研究的不斷深入，缺氧激活的腸上皮間淋巴細(xì)胞(IntestinalIntraepitheliallymphocyte，IEL)

4、分泌的γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)對(duì)腸粘膜屏障損傷發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IFN-γ所致的腸粘膜屏障功能障礙被認(rèn)為與其對(duì)腸上皮間緊密連接(tightjunction，TJ)以及腸上皮細(xì)胞凋亡的影響密切相關(guān)[4]。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)是肌醇與磷脂酰肌醇(phosphatidyl-inositol，PI)的重要激酶，PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與調(diào)

5、節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡與分化等過程。但是對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路參與腸粘膜急性缺血再灌注I/R損傷的作用及機(jī)制并不清楚。
　　缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-induciblefactor1，HIF-1)是一種氧濃度依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是促進(jìn)機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)的最重要的調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路與HIF-1α蛋白表達(dá)關(guān)系密切，但是對(duì)于其調(diào)控機(jī)制，以及該通路在IFN-γ調(diào)控腸粘膜屏障中的作用目前仍不明確，與HIF-1

6、α氧依賴泛素化降解途徑中關(guān)鍵酶PHD的關(guān)系也不明確。
　　因此本課題擬應(yīng)用跨上皮電阻測(cè)定、蛋白印跡、激光共聚焦等技術(shù)，探討I/R早期IFN-γ、HIF-1α、PI3K/AKT信號(hào)途徑活化規(guī)律，以及對(duì)腸粘膜屏障功能維持起關(guān)鍵作用的緊密連接蛋白分子如Claudin-1、Occludin等的表達(dá)及結(jié)構(gòu)的變化，并通過檢測(cè)腸上皮跨上皮電阻TER，明確對(duì)腸粘膜屏障功能調(diào)控的作用。為闡明腸I/R損傷早期PI3K/AKT信號(hào)通路及HIF-1α在腸

7、粘膜屏障功能調(diào)控中的作用機(jī)制，為腸粘膜屏障功能損害與修復(fù)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法
　　1.建立腸上皮細(xì)胞系Caco-2缺氧及IFN-γ干預(yù)模型，通過transwell小室細(xì)胞培養(yǎng)、跨上皮電阻(TER)測(cè)定技術(shù)，了解缺氧及IFN-γ干預(yù)情況下腸上皮細(xì)胞TER的變化情況。
　　2.建立小鼠腸道I/R損傷模型，通過蛋白印跡以及RT-PCR技術(shù)，測(cè)定小鼠腸粘膜中IFN-γ、HIF-1α、PI3K/AKT信號(hào)途徑活化規(guī)律。<

8、br>　　3.結(jié)合PI3K/AKT通路抑制劑LY294002，通過蛋白印跡及激光共聚焦技術(shù)，檢測(cè)IFN-γ對(duì)腸上皮細(xì)胞Caco-2中的TJ蛋白表達(dá)及結(jié)構(gòu)的影響，明確PI3K/AKT通路在IFN-γ調(diào)控腸上皮屏障功能中的作用及機(jī)制。
　　4.在上述體外模型中，通過蛋白印跡及激光共聚焦技術(shù)，檢測(cè)IFN-γ對(duì)HIF-1α蛋白的影響以及脯氨酸羥化酶PHD的表達(dá)變化，利用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002，進(jìn)一步探討PI3K/AKT

9、通路在IFN-γ調(diào)控腸上皮細(xì)胞HIF-1α含量中的作用及可能機(jī)制。
　　主要結(jié)果
　　1.I/R條件下腸粘膜HIF-1α蛋白含量明顯升高，術(shù)后6h達(dá)到峰值;伴隨著腸粘膜IFN-γ表達(dá)增多，PI3K/AKT信號(hào)通路活化增加;
　　2.缺氧引起了腸上皮細(xì)胞TER降低，而IFN-γ加劇了缺氧條件引起的腸上皮屏障功能損害;
　　3.單純?nèi)毖蹩梢源踢M(jìn)體外培養(yǎng)腸上皮Caco-2細(xì)胞HIF-1α蛋白含量增加，并且入核增多，但是

10、對(duì)HIF-1αmRNA水平影響較小;
　　4.外源性IFN-γ作用于培養(yǎng)的腸上皮Caco-2細(xì)胞，可以引起緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin表達(dá)下降，并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)上皮細(xì)胞跨上皮電阻TER明顯降低;
　　5.外源性IFN-γ作用于Caco-2細(xì)胞，可以促進(jìn)PI3K表達(dá)及AKT蛋白磷酸化水平增加;PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用后可以抑制IFN-γ引起的上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)降低，促進(jìn)

11、跨上皮電阻TER恢復(fù)，
　　6.外源性IFN-γ作用于Caco-2細(xì)胞，可以引起HIF-1α蛋白含量增加，同時(shí)PHD1、PHD2表達(dá)減少;而LY294002預(yù)處理可以抑制IFN-γ作用引起的PHD2蛋白表達(dá)減少和HIF-1α蛋白含量增加;
　　結(jié)論
　　1、I/R條件下腸粘膜缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白含量明顯增加;同時(shí)PI3K及AKT蛋白磷酸化水平增加，提示PI3K/AKT信號(hào)途徑參與了HIF-1通路的調(diào)控;

12、　　2、I/R條件下腸粘膜IFN-γ表達(dá)升高，外源性IFN-γ作用于培養(yǎng)的腸上皮Caco-2細(xì)胞，可以引起緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin表達(dá)下降，并且緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)上皮細(xì)胞跨上皮電阻TER明顯降低。
　　3、外源性IFN-γ作用于Caco-2細(xì)胞，可以引起PI3K及AKT蛋白磷酸化水平增加，PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用后可以抑制IFN-γ引起的上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)降低，促進(jìn)跨上皮電阻

13、TER恢復(fù)，提示IFN-γ通過PI3K/AKT通路參與了對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的調(diào)控，從而影響腸上皮屏障功能。
　　4、外源性IFN-γ作用于Caco-2細(xì)胞，可以引起HIF-1α蛋白含量增加，同時(shí)PHD1、PHD2表達(dá)減少;而LY294002預(yù)處理可以抑制IFN-γ作用引起的PHD2蛋白表達(dá)減少和HIF-1α蛋白含量增加，提示PI3K/AKT通路參與IFN-γ對(duì)HIF-1α蛋白的調(diào)控，可能與抑制PHD2蛋白表達(dá)從而促進(jìn)了P