腸急性損傷條件下腸上皮間淋巴細(xì)胞對(duì)腸上皮細(xì)胞作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸黏膜屏障是機(jī)體抵御腸腔病原體入侵的重要屏障。研究表明:缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）、應(yīng)激、放射性損傷等急性病理刺激下，均會(huì)發(fā)生腸黏膜屏障功能受損，導(dǎo)致腸源性感染，加重原發(fā)疾病，最終引起多器官功能衰竭。盡管目前針對(duì)腸黏膜屏障損傷與保護(hù)等領(lǐng)域做了大量研究工作，但腸黏膜屏障中涉及免疫調(diào)控與免疫反應(yīng)的機(jī)制仍未闡明。針對(duì)當(dāng)前腸黏膜屏障急性損傷后繼發(fā)的免疫功能紊亂甚至免疫反應(yīng)介導(dǎo)的“二次損

2、傷”等復(fù)雜問(wèn)題，迫切要求我們闡明腸黏膜免疫功能紊亂及調(diào)節(jié)的關(guān)鍵機(jī)制，為急性病理?xiàng)l件下腸黏膜屏障保護(hù)提供新策略。
　　作為腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要一員，腸上皮間淋巴細(xì)胞(Intraepithelial lymphocyte，IELs)是定植于腸上皮細(xì)胞間的一類獨(dú)特的淋巴細(xì)胞群。IELs由多種亞群構(gòu)成，主要包括TCRγδ+T細(xì)胞、TCRαβ+T細(xì)胞。TCRαβ+IELs又可分為TCRαβ+CD8αα+IELs、TCRαβ+CD8αβ+IE

3、Ls和TCRαβ+CD4+IELs三個(gè)亞群;TCRγδ+幾乎全部為CD8αα+。IELs的多亞群構(gòu)成，也提示了它們來(lái)源的多樣性。因此，IELs來(lái)源多樣，功能復(fù)雜，已成為近年來(lái)腸道免疫研究的熱點(diǎn)。在生理情況下，IELs分泌細(xì)胞因子（如KGF）、抗菌肽等，維持上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及抵御病原體入侵;病理情況下，IELs能快速做出應(yīng)答，從半活化狀態(tài)迅速進(jìn)入活化狀態(tài)，分泌細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)這些細(xì)胞因子也可能介導(dǎo)對(duì)腸黏膜的損傷，導(dǎo)致屏障功能下降。<

4、br>　　前期研究發(fā)現(xiàn)，小腸I/R可以直接損傷腸上皮細(xì)胞以及細(xì)胞間連接。例如:腸黏膜絨毛的明顯斷裂、脫落和腸道上皮細(xì)胞的凋亡增加、壞死;維持IELs在上皮細(xì)胞間定植的緊密連接蛋白（Claudin-1和Occludin）結(jié)構(gòu)破壞;腸黏膜通透性增加。我們?cè)诓∪巳毖哪c道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，IL-7表達(dá)增多。IL-7作為腸上皮細(xì)胞分泌的、刺激淋巴細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞因子，在維持IELs表型和功能方面發(fā)揮了重要作用。在我們課題組前期構(gòu)建的IL-7腸道過(guò)表達(dá)小

5、鼠中發(fā)現(xiàn)，IELs表現(xiàn)為Th1型細(xì)胞因子分泌增多，活化標(biāo)志CD69+表達(dá)上調(diào)。提示:IL-7的上調(diào)，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞過(guò)度活化，參與炎癥反應(yīng)。IELs無(wú)論空間距離和功能調(diào)控都與腸上皮細(xì)胞有著緊密聯(lián)系。因此，我們推測(cè)I/R可導(dǎo)致IELs的過(guò)度活化，同時(shí)，活化后的IELs介導(dǎo)了對(duì)腸黏膜屏障的損傷。我們?cè)诒菊撐闹兄攸c(diǎn)探討小腸I/R條件下IELs的功能變化，以及其對(duì)上皮屏障產(chǎn)生的影響。同時(shí)，我們也注意到，急性放射性損傷可以導(dǎo)致上皮細(xì)胞大量死亡，由上皮

6、細(xì)胞分泌的IL-7是否會(huì)受到影響。那么，這種情況下，IELs又將發(fā)生什么變化呢？我們針對(duì)這一問(wèn)題也將進(jìn)行初步的探討。
　　因此本研究運(yùn)用流式細(xì)胞分選，IELs上清與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)、免疫組化、蛋白印跡、ELISA等技術(shù)，探討I/R和急性放射性損傷條件下（以I/R為重點(diǎn)），IELs亞型及功能的變化規(guī)律，以及IELs功能改變后對(duì)腸黏膜屏障損傷的相關(guān)機(jī)制。其中包括:明確對(duì)上皮屏障造成損傷的IELs源性細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子對(duì)緊密連接蛋白如C

7、laudin-1、Occludin等的表達(dá)及結(jié)構(gòu)變化情況;并通過(guò)檢測(cè)跨上皮電阻抗(TER)，確定IELs對(duì)屏障功能的調(diào)控作用;最后人為干預(yù)該細(xì)胞因子，評(píng)估腸屏障損傷的改善情況。為進(jìn)一步闡明腸急性損傷條件下IELs的變化規(guī)律及其調(diào)控腸黏膜屏障的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，為腸黏膜屏障損傷干預(yù)提供新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　建立小鼠急性小腸I/R模型及急性放射性損傷模型，運(yùn)用HE染色，免疫組化，Ussing Chamer，Western

8、 Blot等技術(shù)了解急性損傷情況下腸黏膜的改變情況。
　　圍繞腸I/R模型，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)、免疫組化、定量PCR技術(shù)，闡明I/R條件下IELs表型和功能變化規(guī)律。
　　運(yùn)用流式細(xì)胞分選IELs，結(jié)合IELs上清與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型，明確IELs源性細(xì)胞因子TNF-α對(duì)上皮細(xì)胞的作用，以及細(xì)胞因子對(duì)上皮間緊密連接蛋白表達(dá)及結(jié)構(gòu)的影響。
　　使用抗TNF-α抗體術(shù)前干預(yù)，通過(guò)跨上皮電阻抗(TER)及組織損傷評(píng)分的技術(shù)手段

9、，明確IELs源細(xì)胞因子在腸黏膜屏障損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:
　　腸I/R條件下，小腸黏膜正常結(jié)構(gòu)受損，絨毛斷裂，上皮下間隙增大，上皮脫落，固有層細(xì)胞成分增多，腸黏膜通透性增大。
　　腸I/R后腸黏膜緊密連接蛋白(Claudin-1，Occludin)表達(dá)下降，Occludin在上皮細(xì)胞頂端正常結(jié)構(gòu)遭到破壞。急性腸I/R對(duì)IELs數(shù)量沒(méi)有影響，但導(dǎo)致IELs與上皮細(xì)胞的正常連接消失。
　　腸I/R條件下

10、，上皮細(xì)胞分泌IL-7增多，IELs亞群CD8αβ+，CD4+和TCRαβ+的百分比增高，CD8+，CD4+IELs凋亡先后開(kāi)始啟動(dòng)。并且CD8+，CD4+IELs活化顯著增加，TNF-α、IL-10 mRNA拷貝數(shù)增多，KGF減少，IFN-γ沒(méi)有明顯變化。
　　I/R處理后的IELs上清與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞Claudin-1、Occludin表達(dá)下降，Occludin結(jié)構(gòu)完整性破壞，上皮屏障通透性增高，在I/R處理后

11、的IELs上清中加入TNF-α抗體，可以逆轉(zhuǎn)上述改變。
　　I/R處理后，CD45+IELs胞內(nèi)合成以及分泌的TNF-α增多，用IL-7刺激體外培養(yǎng)的IELs后，TNF-α分泌明顯增多?？筎NF-α治療可以顯著緩解I/R小鼠腸黏膜損傷。
　　急性放射性腸損傷直接導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，絨毛形態(tài)不能正常維持，凋亡細(xì)胞增多，腸道IL-7表達(dá)降低，腸道IELs細(xì)胞數(shù)量72h后減少非常明顯。給予外源性IL-7處理，急性放射性腸損傷導(dǎo)

12、致的IELs數(shù)量降低得到改善。
　　結(jié)論:
　　急性I/R條件下:IELs受到影響，表現(xiàn)為與上皮細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破壞，IELs亞群比例失調(diào);IELs活化增加，其分泌的TNF-α介導(dǎo)了對(duì)上皮細(xì)胞的損傷以及上皮間緊密連接蛋白正常結(jié)構(gòu)的破壞?？筎NF-α治療可以顯著改善腸黏膜損傷。
　　急性放射性腸損傷條件下:腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，絨毛形態(tài)不能維持，凋亡細(xì)胞增多，腸道上皮表達(dá)IL-7降低是IELs細(xì)胞數(shù)量減少的重要因素之一，給予