腸缺血再灌注條件下AhR活化對(duì)腸上皮屏障功能的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　腸缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，I/R)損傷是造成腸屏障功能衰竭(Intestinal Barrier Failure，IBF)的常見(jiàn)誘因，可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞(Intestinal Epithelial Cells，IEC)剝脫，粘膜通透性增加，腸內(nèi)細(xì)菌移位，繼發(fā)腸源性感染，最終導(dǎo)致多器官衰竭(Multiple Organ Failure，MOF)。而存在于相鄰的腸上皮細(xì)胞膜間的緊密連接(T

2、ight Junctions，TJs)則是組成腸上皮屏障（Intestinal Epithelial Barrier,IEB）的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它調(diào)控細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸，建立細(xì)胞極性，抵御外來(lái)病原微生物入侵，對(duì)IEB的維持具有至關(guān)重要的作用。
　　研究表明，芳香烴受體(Aryl Hydrocarbon Receptor,AhR)對(duì)腸道免疫屏障(Intestinal Immunologic Barrier,IIB)的維持發(fā)揮重要作用。A

3、hR活化可調(diào)節(jié)腸上皮間淋巴細(xì)胞的亞群及分布，上調(diào)抑炎因子IL-10、IL-22等的表達(dá)，下調(diào)促炎因子IFN-γ、TNF-α等的表達(dá)，顯著緩解動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎癥狀。而其對(duì)IEB功能的作用及機(jī)制迄今仍不十分清楚。Notch1作為AhR調(diào)控的下游基因群(Gene Battery)中的一員已被證實(shí)。同時(shí)，Notch1信號(hào)通路對(duì)IEB的維持及TJ蛋白的表達(dá)具有重要作用也有文獻(xiàn)報(bào)道。由于AhR及其下游Notch1均表達(dá)于IEC，因此推測(cè)，AhR活化

4、對(duì)IEB具有保護(hù)作用，且AhR-Notch1信號(hào)通路調(diào)控TJ蛋白的表達(dá)可能是其維持IEB功能的潛在機(jī)制。
　　本文擬通過(guò)建立體內(nèi)腸I/R模型及體外Caco-2細(xì)胞缺氧(Hypoxia)模型，應(yīng)用Western Blot、Realtime-qPCR、免疫組化、免疫熒光、跨上皮電阻(Trans-epithelium Electrical Resistant,TER)檢測(cè)等技術(shù)，檢測(cè)AhR-Notch1信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，TJ蛋白(

5、ZO-1，Occludin)的表達(dá)及腸粘膜通透性的變化，探討AhR活化如何參與并調(diào)控IEB功能，并闡明其中的作用機(jī)制，為臨床腸I/R損傷的預(yù)防、治療以及IEB功能的維持提供新的理論依據(jù)和靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、建立小鼠腸I/R模型，應(yīng)用H&E染色、腸粘膜損傷邱氏評(píng)分(Chius'Score)、尤斯灌流小室系統(tǒng)(Ussing Chambers)檢測(cè)TER等方法，觀察各組小鼠腸粘膜損傷情況以及腸上皮通透性變化。
　　2

6、、應(yīng)用免疫組化、Western Blot等技術(shù)，觀察各組小鼠腸粘膜TJ蛋白(ZO-1，Occludin)的表達(dá)及分布的變化。
　　3、應(yīng)用免疫組化、Realtime-qPCR、Western Blot等技術(shù)，觀察各組小鼠腸粘膜AhR-Notch1信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)、分布以及活性的變化。
　　4、構(gòu)建體外Caco-2細(xì)胞缺氧模型，模擬體內(nèi)I/R損傷，應(yīng)用免疫熒光、Western Blot等技術(shù)，觀察缺氧條件下，AhR活化對(duì)

7、下游Notch1信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)及活性情況。
　　5、應(yīng)用免疫熒光、Western Blot、電阻儀檢測(cè)TER等技術(shù)，進(jìn)一步觀察缺氧條件下，AhR活化對(duì)各組細(xì)胞TJ蛋白(ZO-1，Occludin)的表達(dá)以及對(duì)膜通透性的影響。
　　6、應(yīng)用Western Blot技術(shù)，觀察缺氧條件下，同時(shí)給予Notch1信號(hào)阻斷劑DAPT和AhR激動(dòng)劑Ficz，各組細(xì)胞AhR-Notch1通路相關(guān)蛋白及TJ蛋白(ZO-1，Occlud

8、in)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、小鼠腸I/R模型中，IEC正常組織結(jié)構(gòu)被破壞：絨毛倒伏、斷裂、充血水腫、脫落;邱氏組織學(xué)損傷評(píng)分增加;腸粘膜TER下降，通透性增加。腹腔注入AhR激動(dòng)劑Ficz可明顯緩解腸I/R所致粘膜損傷及IEB的破壞。
　　2、小鼠腸I/R模型中，TJ蛋白(ZO-1，Occludin)的連續(xù)性中斷，表達(dá)下降。注入Ficz可使被破壞的TJ蛋白(ZO-1，Occludin)的分布及表達(dá)有所恢復(fù)。

9、
　　3、小鼠腸I/R模型中，AhR-Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)減弱。而注入Ficz可顯著上調(diào)它們的表達(dá)及活性。
　　4、體外Caco-2細(xì)胞缺氧模型中，AhR-Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)同樣減弱;TJ蛋白(ZO-1，Occiudin)的形態(tài)破壞，表達(dá)減弱;TER下降。Ficz活化的AhR可促進(jìn)Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá);并維持了TJ蛋白(ZO-1，Occludin)的表達(dá)及分布;緩解了缺氧所致IEB功能障礙。

10、r>　　5、體外Caco-2缺氧模型中，應(yīng)用DAPT阻斷下游Notch1通路不影響Ficz對(duì)AhR的活化作用;但其可阻斷Ficz對(duì)TJ蛋白(ZO-1，Occludin)的上調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　1、AhR活化能夠通過(guò)調(diào)控腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達(dá)顯著緩解腸粘膜通透性的增加，從而發(fā)揮其對(duì)腸上皮屏障的保護(hù)作用。
　　2、AhR活化對(duì)下游Notch1信號(hào)通路的調(diào)控是AhR調(diào)控緊密連接蛋白表達(dá)的