腸缺血再灌注后腸黏膜屏障功能改變及機制研究.pdf

1、研究背景和目的： 1、MODS最初的病理形態(tài)記述多為患者死后尸檢所見，系晚期病變。以后陸續(xù)有了動態(tài)的、較系統(tǒng)的動物實驗病理學研究資料。但動物實驗對象主要為大鼠、家兔、山羊等，用這些離人類種屬差異較大的動物實驗資料尚難解釋很多臨床現(xiàn)象。靈長類動物獼猴在生理上與人類較接近，本系列研究擬通過觀察了IIR獼猴觀察靈長類動物IIR后重要器官病理及功能變化。 2、由于腸道在MODS發(fā)生中，不僅是受損器官，更是全身炎癥反應的策源地，本

2、研究將比較腸缺血再灌注前后腸粘膜及外周血中SST水平，以求證內(nèi)源性SST在MODS發(fā)生中的可能重要作用。進一步明確SST是否對人類MODS有預防或治療作用?以期獲得對臨床治療MODS有實用價值的信息。 3、防御素(defensin)是生物在長期進化過程中保留下來的一種古老的宿主防御機制，是抵御外來微生物入侵的重要物質(zhì)。位于小腸隱窩基底部的潘氏細胞可合成、分泌腸源性防御素，它可能通過損傷細菌細胞膜對多種細菌發(fā)揮強大的殺菌活性，是腸

3、粘膜屏障的重要組成部分，在腸道天然免疫中具有重要作用。我們近期的研究觀察到，腸缺血再灌注(intestinal ischemia repeffusion，IIR)后，小腸腔內(nèi)細菌量較正常增加約2×10<'6>倍。腸源性防御素對此的反應如何?腸道作為多器官功能障礙綜合癥(multiorgan dysfunction syndrome，MODS)的重要策源地，是否因腸腔內(nèi)大量細菌與腸源性防御素之間的失衡有關?腸粘膜內(nèi)顯著變化的SST與腸源性

4、防御素是否具有相關性?IIR后小腸粘膜強烈的天然免疫反應與腸源性防御素有何關聯(lián)腸道作為多器官功能障礙綜合癥(multiorgandysfunction syndrome，MODS)的重要策源地，是否因腸腔內(nèi)大量細菌與腸源性防御素之間的失衡有關?4、腸相關淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue，GALT)是體內(nèi)最大的免疫器官，GALT產(chǎn)生的抗體量多于其它淋巴器官(脾、淋巴結(jié)、骨髓)產(chǎn)生抗體量的總和，其中分泌

5、型lea的產(chǎn)量為3-5g／天，生理情況下體液免疫腸道免疫中占有舉足輕重的地位。只有個別的研究報導，IIR后腸道T、B淋巴細胞數(shù)量減少，腸腔lea的總量基本沒變，但沒有slgA的更多資料。由于分泌型Iea(secretory Immunoglobulin A sIgA)的分泌涉及Iea單體、J鏈、IgA雙體、分泌片(secretory component，SC)等眾多環(huán)節(jié)，腸道真正發(fā)揮作用的是sIgA。而且有關腸粘膜體液免疫研究的實驗對象

6、又主要為大、小鼠，用這些離人類種屬差異較大的動物實驗資料尚難準確解釋很多臨床現(xiàn)象。再加上臨床上腸道標本取材的不可行性，人體內(nèi)IIR后腸粘膜體液免疫發(fā)生了什么樣的改變，這種變化在IIR后的后續(xù)病理改變中又占有怎樣的位置，目前仍不清楚。本研究擬通過觀察與人類種屬關系接近的動物—獼猴IIR時腸粘膜體液免疫中漿細胞、Iea、分泌片、slgA所發(fā)生的變化，從多個層面探討IIR對腸體液免疫功能的影響。 研究方法： l、動物：全部實

7、驗所用健康成年獼猴來自成都野生動物世界，雌雄不限，體重4～6Kg。15只健康獼猴分為3組，每組5只動物。 正常對照組：給獼猴肌注復方二甲苯胺噻嗪(解放軍軍需大學獸醫(yī)研究所，長春，中國)以麻醉動物，0.06～0.24ml／kg。動物麻醉后，采集外周靜脈血及手術取出小腸、心、肝、腎、肺、腦等器官進行組織學觀察。 ⅡR組：麻醉同前，實驗過程中用安定靜注0.16±0.09mg/Kg/h維持昏睡狀態(tài)。無菌鋪巾，沿腹正中切開，分離腸

8、系膜上動脈后予以夾閉，60 min后松夾進行再灌注，恢復腸系膜上動脈血流。再灌注后1h，靜脈輸入0.9[％]鹽水，0.1～0.2ml/kg/min。24h后取出各臟器。 ⅡR+SST組：大部分同ⅡR組，僅在夾閉腸系膜上動脈前，從靜脈滴注生長抑素5μg/Kg/h，持續(xù)至再灌注后24h，處死動物，取出各臟器。與正常和ⅡR組比較其病理和功能變化2、實驗方法用大體病理檢查及H-E染色光鏡下觀察評估各重要臟器官組織病理損傷程度，并于術前

9、后實驗結(jié)束后血中肝、腎功能，血常規(guī)、DIC等研究。觀察實驗動物臨床表面。 用放射免疫測定法測定外周血中的生長抑素的含量；用放射免疫法及免疫組織化學法測定回腸粘膜中生長抑素的含量。用EIASA測定回腸組織中β-防御素-2和分泌型IgA的含量。用免疫組織化學加圖像分析測定回腸組織中α-防御素-6、IgA、漿細胞、分泌片的含量。 研究結(jié)果 l、外周血與小腸粘膜中SST的變化放射免疫分析結(jié)果表明，ⅡR后外周血SffT較正

10、常對照明顯下降，靜脈補充SST后，循環(huán)中SST水平回升。正常獼猴小腸粘膜隱窩部可見SST陽性染色；ⅡR后，粘膜SST明顯減少。ⅡR前靜脈預防性應用SST后，粘膜SST較ⅡR組明顯回升。 2、SST改善ⅡR引起的器官組織損傷 預防性使用SST后，重要臟器病理組織學較IIR時組織水腫減輕，細胞變性和壞死明顯減少。其中肺、小腸、肝、腎和胰腺的損傷評分從+++降到++，大腸、大腦和小腦的損傷評分從++降到+。IIR及IIR+SS

11、T時，心臟均無明顯組織病理改變。 IIR+SST組獼猴在腸缺血后早期血壓變化與IIR組一致，平均動脈壓在2h內(nèi)急速下降到最低值，但恢復腸系膜上動脈血流灌注及靜脈補液后，IIR+SST組的平均動脈壓穩(wěn)定回升，18h后穩(wěn)定在術前水平，明顯高于IIR組；心率和呼吸升高幅度在IIR后16h也較IIR組低而穩(wěn)定。動物血中ALT、AST及BUN雖然仍高于正常，但明顯低于IIR組(P<0．05)。出現(xiàn)腹脹的時間較IIR組明顯延遲(IIR后10

12、-14h)，而且僅為胃內(nèi)積氣，小腸積氣不明顯；體溫<35℃的時間明顯短于IIR組(持續(xù)24h)，平均為2h，實驗結(jié)束前體溫均>37℃，最高達38．3℃ 3、SST對腸道防御不的影響 IIR后，粘膜隱窩部的a-防御素-6明顯減少，預防性補充SST后，粘膜隱窩部的α-防御素-6顯著回升，與正常時無顯著差異。IIR后隱窩部β-防御素-2明顯增加，預防性補充SST后，粘膜隱窩部的β-防御素-2仍持續(xù)增加。 二、IIR后體

13、液免疫變化 正常組見漿細胞大量分布在粘膜層(特別是固有層)，在粘膜下層呈散在分布。IIR組粘膜層(上皮內(nèi)+固有層)漿細胞明顯減少(p<0．05)；IIR+SST組粘膜層漿細胞較IIR組明顯增多(p<0．05)，仍少于正常組；IIR組固有層無IgA的表達，粘膜下層IgA減少，腸腔明顯減少。IIR+SST組粘膜下層IgA較IIR組增多，腸腺隱窩腔內(nèi)出現(xiàn)Iga。 ELIS A檢測發(fā)現(xiàn)IIR組和IIR+SST組腸上皮及腸腔sIg

14、A的水平在兩組之間沒有差異(p>0.05)，但都明顯低于正常。正常獼猴腸粘膜上皮細胞SC染色淡，主要位于絨毛上皮細胞的腔面和基底面，而腸腔濃染明顯。IIR組上皮細胞的腔面和基底面的SC分泌都明顯增多。IIR+SST組SC較正常似有增多，但積分光密度無統(tǒng)計學差異(p>0.05)結(jié)論： 1、嚴重的腸道缺血對全身循環(huán)的負面影響遠大于肢體或其它器官血容量下降的后果，其組織病理的炎性損傷特征是含免疫細胞多的臟器最先受累，這些結(jié)果增進了對

15、人類MODS發(fā)生的認識。 2、SST對IIR后MODS有良好的預防效果。 3、IIR時小腸內(nèi)細菌過度生長及菌群譜的變化與粘膜內(nèi)a-防御素-6和β-防御素-2的變化無關；小腸隱窩內(nèi)變化的a-防御素-6受SST調(diào)控，可能影響隱窩部位多種細胞的生理功能；小腸隱窩內(nèi)β-防御素-2主要受粘膜內(nèi)NF-κB及炎癥介質(zhì)的誘導，發(fā)揮其免疫趨化的作用。 4、IIR將使腸道體液免疫遭到嚴重破壞。SST可促進粘膜及粘膜下漿細胞的成熟和聚