丙酮酸鹽對(duì)大鼠小腸缺血再灌注引起的腸屏障損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:近年來的研究發(fā)現(xiàn)靜脈或腸內(nèi)給予丙酮酸鈉能夠減輕燒傷和失血性休克等引起的腸屏障損傷和遠(yuǎn)隔器官功能障礙，但是其潛在的機(jī)制尚不清楚;最近的研究證實(shí)丙酮酸鹽能夠增加缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的表達(dá)，減輕缺血再灌注(I/R)引發(fā)的器官組織損傷。因此，本研究假設(shè)丙酮酸可能通過上調(diào)腸I/R時(shí)HIF-1信號(hào)通路及其下游靶基因的表達(dá)，影響腸上皮細(xì)胞的屏障功能。本研究目的:1.采用空腸袋缺血再灌注模型，比較丙酮酸鹽溶液、葡萄糖溶液和枸櫞酸鹽溶液對(duì)I

2、/R引起的腸屏障損害的保護(hù)作用;2.研究腸I/R時(shí)丙酮酸鹽通過上調(diào)HIF-1及其下游靶基因的表達(dá)、影響腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:120只清潔級(jí)大鼠，體重220g-260g，購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為①正常對(duì)照組（S組）②丙酮酸鈉組(IP組)③葡萄糖組(IG組)④枸櫞酸鈉組(IC組)⑤生理鹽水對(duì)照組(IS組);分三個(gè)時(shí)間點(diǎn):缺

3、血30min(I30)、缺血60min(I60)和缺血60min后再灌注30min(R30)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。
　　 2.大鼠腸袋I/R模型:鹽酸氯胺酮注射液與速眠新Ⅱ注射液按體積比2∶1混合，0.5mL/kg腹部注射麻醉后，用保溫毯維持體溫在37℃左右。在麻醉狀態(tài)下沿腹白線行無菌開腹手術(shù)，游離屈氏韌帶遠(yuǎn)端5cm的空腸，制作8cm大小的腸袋，近端置入激光多普勒血流儀用絲線結(jié)扎固定，遠(yuǎn)端結(jié)扎，往腸內(nèi)灌注入液體（生理鹽水、丙酮酸

4、鈉溶液10mmol/L、葡萄糖溶液10mmol/L或者枸櫞酸鈉溶液10mmol/L），行腸系膜上動(dòng)脈分離，用無傷動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈起始部，夾閉30min或者60min，或者夾閉60min后恢復(fù)血流30min，制成本模型的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在夾閉腸系膜上動(dòng)脈后，I30、I60和R30檢測(cè)腸粘膜血流量。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)通過腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠。正常對(duì)照組進(jìn)行手術(shù)操作，制作腸袋，不夾閉腸系膜上動(dòng)脈。
　　 指標(biāo)檢測(cè)與方法:①腸黏膜損傷形態(tài)學(xué)觀

5、察和評(píng)分;②測(cè)定小腸黏膜屏障功能指標(biāo)二胺氧化酶(DAO);③小腸黏膜屏障功能指標(biāo):采用免疫熒光雙標(biāo)法標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡觀察腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的形態(tài)變化;④Westernblot方法檢測(cè)腸組織ZO-1、HIF-1、丙酮酸脫氫酶激酶(PDK1)及促紅細(xì)胞生成素(EPO)表達(dá);⑤測(cè)定誘生型和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（iNOS和eNOS），一氧化氮(NO);⑥激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)腸黏膜血流量(IMBF);⑦腸組織過氧化指標(biāo):丙二醛(M

6、DA)含量、黃嘌呤氧化酶(XOD)活性和過氧化氫(H2O2);
　　 結(jié)果:
　　 1.腸黏膜損傷病理評(píng)分，各組在腸系膜上動(dòng)脈夾閉后，出現(xiàn)明顯的損傷，各時(shí)間點(diǎn)絨毛損傷不一樣，IP組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的絨毛損傷明顯較其他各組輕，IG組與IS組相比絨毛損傷較輕，IC組與IS組比較損傷無明顯差別。
　　 2.DAO:腸缺血在灌注損傷后，DAO活性較S組明顯降低，IP口組較其他缺血損傷組DAO含量顯著增高(P＜0.05)，IG

7、組較IS組DAO含量顯著增高(P＜0.05)，IC與IS組比較損傷無明顯差別。
　　 3.緊密連接蛋白ZO-1:(1)通過免疫印跡法分析ZO-1蛋白條帶平均光密度值，與正常組比較，缺血再灌注損傷后各組蛋白表達(dá)較S組明顯降低;IP組顯著高于其他各損傷組，IG組較IS組高，IC組與IS組相比較無明顯差別;(2)S組腸粘膜ZO-1蛋白陽性表達(dá)，熒光信號(hào)強(qiáng)，呈緊密連接;而其它各實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)則相對(duì)不明顯，呈現(xiàn)斷裂連接，提示ZO-1蛋白

8、重新分布或表達(dá)降低。IS組的ZO-1蛋白明顯減少，甚至消失;IP組的ZO-1蛋白表達(dá)低于正常組，但是較其他各組明顯增多;IP組ZO-1蛋白表達(dá)比IS組明顯增多，熒光信號(hào)較強(qiáng)。
　　 4.Westernblot:腸組織缺血情況下，較S組HIF-1表達(dá)顯著增多，HIF-1誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)也增多。IP組較其他各組HIF-1的表達(dá)明顯增多，IG組與IS組相比HIF-1表達(dá)增加，IC組與IS組之間無明顯差別;在HIF-1的誘導(dǎo)下，IP組

9、的PDK1和EPO的表達(dá)較其他組也明顯增加，IG組與IS組比較PDK1和EPO表達(dá)增加，IC組與IS組之間無明顯差別。
　　 5.eNOS、iNOS和NO:缺血再灌注損傷后各組eNOS和iNOS活性均明顯升高，各組eNOS和iNOS活性之和無明顯差別，IS組eNOS活性顯著低于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS組與IC組間無明顯差別;IS組iNOS活性高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS

10、組與IC組間無明顯差別;IS組NO活性顯著低于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS與IC組間無明顯差別。
　　 6.IMBF值:與S組比較，夾閉腸系膜上動(dòng)脈后各缺血組IMBF明顯下降;IP組與IS組比較IMBF顯著回升(P＜0.01);IG與IS組比較IMBF明顯回升(P＜0.05)，IC與IS組間沒明顯差別。
　　 7.XOD、H2O2和MDA:缺血再灌注損傷后各組腸組織XOD、H2O2和MDA含量均

11、明顯升高，與損傷程度成正相關(guān);IS組XOD活性顯著高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，且IS組與IC組間無明顯差別;IS組H2O2含量顯著高于顯著高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，IC組與IS組相比H2O2含量明顯較多(P＜0.05);IS組MDA含量顯著高于IP組(P＜0.01)和IG組(P＜0.05)，IC組與IS組比較MDA含量明顯較多（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.丙