腸缺血再灌注刺激下GSNO在調(diào)控腸粘膜屏障功能中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腸粘膜屏障(Intestinal epithelial barrier, IEB)是機(jī)體抵御外界病原及微生物侵襲的重要屏障，其主要的生物組成結(jié)構(gòu)是由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障及免疫屏障共同構(gòu)成的，其中的機(jī)械屏障是組成IEB的結(jié)構(gòu)及功能基礎(chǔ)，由完整的腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cell，IEC)以及上皮細(xì)胞間的緊密連接(Tight junction，TJ)而構(gòu)成的物理屏障。近年來研究顯示，腸

2、膠質(zhì)細(xì)胞(emeric glial cell，EGC)作為腸神經(jīng)系統(tǒng)(emeric nerve system，ENS)中最為豐富的細(xì)胞類型，不僅對(duì)腸神經(jīng)細(xì)胞在營養(yǎng)支持及保護(hù)方面發(fā)揮重要的作用，同時(shí)也在維持IEB功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，EGC的異常與多種腸道疾病引起的腸粘膜通透性增加及IEB功能障礙關(guān)系密切，敲除EGC的小鼠可引起暴發(fā)性腸道炎癥以及IEB功能瓦解。
　　嚴(yán)重創(chuàng)傷、腸道梗阻及大型手術(shù)所誘發(fā)的急性小

3、腸缺血再灌注(ischemiareperfusion，I/R)損傷是臨床上救治的重要難題之一。特別是近年來的一些大型血管手術(shù)的開展及聯(lián)合器官移植、心肺轉(zhuǎn)流等各種特大型手術(shù)日益的增多，極易引起的小腸低血流缺血和再灌注導(dǎo)致的總多的促炎癥介質(zhì)釋放，誘發(fā)急性小腸I/R損傷，這已成為影響手術(shù)預(yù)后的評(píng)判和患者生存的重要因素。大量的研究已顯示，急性小腸I/R損傷已成為當(dāng)今臨床上導(dǎo)致腸粘膜屏障功能受損，甚至誘發(fā)多器官障礙的重要原因之一。因此，進(jìn)一步探討

4、小腸I/R的IEB損傷機(jī)制，提高小腸I/R后IEB功能的保護(hù)是臨床上亟待解決的熱點(diǎn)問題。
　　本課題組的前期研究已顯示，小腸I/R損傷可快速誘導(dǎo)EGC的明顯活化，EGC可明顯抑制體外缺氧再復(fù)氧(hypoxia reperfusion，HR)刺激對(duì)腸上皮細(xì)胞(intestinalepithelial cell，IEC)屏障功能的損傷作用，顯示出EGC在小腸I/R刺激中可能充當(dāng)?shù)哪c道保護(hù)者角色，但其具體分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，進(jìn)一

5、步闡明急性小腸I/R刺激下EGC參與調(diào)控IEB功能中的作用機(jī)制成為本項(xiàng)目關(guān)注重點(diǎn)。
　　近年有多個(gè)研究顯示，亞硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione，GSNO)可能是EGC參與調(diào)控IEB功能的一個(gè)關(guān)鍵分子。作為亞硝基硫醇(S-nitrosothiol，SNO)在有機(jī)體內(nèi)的主要存在形式，GSNO可能通過調(diào)節(jié)一氧化氮(nitric oxide，NO)儲(chǔ)存和釋放來發(fā)揮其生物性活性。新近研究還發(fā)現(xiàn)，亞硝基谷胱甘肽還原酶(G

6、SNO reductase，GSNOR)是GSNO代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵性還原酶，能通過還原GSNO成為氧化型GSH(oxidized GSH，GSSG)控制細(xì)胞內(nèi)NO水平。作為腸道內(nèi)GSNO的重要來源，EGC源性的GSNO已被證實(shí)可以緩解腸道致病菌感染對(duì)腸上皮細(xì)胞的侵襲破壞作用，減輕腸道炎癥反應(yīng)，這可能是EGC發(fā)揮IEB保護(hù)功能的重要機(jī)制。
　　基于上述，本研究基于體外EGC-Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)模型觀察了正常條件及HR條件下E

7、GC對(duì)IEB功能的保護(hù)作用。同時(shí)，通過建立小鼠腸急性I/R模型及體外HR模型，驗(yàn)證了GSNO預(yù)處理對(duì)I/R刺激下腸粘膜通透性的改變及IEB功能的保護(hù)作用。運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)，抑制EGC細(xì)胞GSNOR的表達(dá)，對(duì)比觀察體外HR模型中，GSNO對(duì)EGC調(diào)控IEB功能的影響。
　　內(nèi)容和方法：
　　1.通過GSNO預(yù)處理及建立EGC-Caco-2細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，分別使用跨上皮電阻(transepithelial res

8、istance，TER)、免疫熒光、及Western Blot技術(shù)檢測緊密連接(tightjunction，TJ)蛋白等觀察了正常條件及HR刺激下EGC及GSNO對(duì)腸上皮通透性及緊密連接蛋白的影響。
　　2.建立小鼠急性腸I/R模型，給予GSNO預(yù)處理，使用Ussing Chamber及免疫熒光技術(shù)觀察小鼠腸粘膜損傷情況、腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)分布及腸粘膜通透性的變化情況。
　　3.通過慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)抑制EGC細(xì)

9、胞GSNOR的表達(dá)，采用高效液相色譜液質(zhì)聯(lián)用（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測HR急性病理刺激條件下EGC中GSNO的濃度變化及對(duì)IEB功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與Caco-2細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，EGC共培養(yǎng)及GSNO預(yù)處理提高了Caco-2細(xì)胞層TER值17.2％和15.2％(P＜0.05)，TJ蛋白Occludin及ZO-1的表達(dá)分別上調(diào)29.8％和32

10、.2％(P＜0.05)。
　　2.HR刺激下Caco-2細(xì)胞層TER值較常氧組下降31.8％(P＜0.05)，Occludin、ZO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別降低了49.1％和43.2％(P＜0.05)。而GSNO預(yù)處理后Caco-2細(xì)胞層TER值較HR組升高21.3％(P＜0.05)，TJ蛋白Occludin及ZO-1表達(dá)分別上調(diào)了35.6％、40.4％(P＜0.05)。
　　3.小鼠腸I/R后，小腸黏膜正常結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，腸

11、絨毛明顯充血水腫、固有層細(xì)胞成分增多，腸黏膜通透性增大，跨膜電阻抗下降（156阻抗8.5Ω·cm2，P＜0.05），緊密連接蛋白表達(dá)及分布異常，而給予GSNO預(yù)處理后，腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞減輕，絨毛部分水腫（Chiu氏評(píng)分2-3分）跨膜電阻抗升高31.4％(P＜0.05)。
　　4.在小鼠I/R模型及體外HR條件下，EGC中GSNOR蛋白及RNA水平分別上升了39.7％和43.4％(P＜0.05)，而GSNO在EGC細(xì)胞中濃度下降45.

12、5％(P＜0.05)。
　　5.HR刺激下，GSNOR-/-EGC細(xì)胞中GSNO含量比對(duì)照組上升了48.6％(P＜0.05)。且在與Caco-2共培養(yǎng)模型中，Caco-2細(xì)胞層TER值提高33％(P＜0.05)，TJ蛋白o(hù)ccludin及ZO-1的表達(dá)上調(diào)35.1％和38.9％。
　　結(jié)論：
　　1.無論在正常生理?xiàng)l件還是在體外HR刺激及體內(nèi)I/R模型下，GSNO均可發(fā)揮對(duì)IEB功能的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用可能與GS