MBL在內(nèi)毒素刺激條件下對腸粘膜屏障功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸上皮細(xì)胞是排列于腸道的單層上皮細(xì)胞，隔絕外界環(huán)境影響，保護(hù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要器官。它的功能主要包括營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和防御外界侵襲的防御功能。腸道的吸收功能維持身體所必須的營養(yǎng)物質(zhì)包括糖，脂肪，蛋白質(zhì)，氨基酸，維生素和微量元素等。腸道的防御功能是以屏障的防御功能為主，主要由四個(gè)部分構(gòu)成即化學(xué)屏障、生物屏障、免疫屏障和機(jī)械屏障[1-4]。其中機(jī)械和免疫屏障之間存在相互調(diào)控進(jìn)而增強(qiáng)了屏障的防御功能，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的核

2、心。炎癥性腸病(IBD)、全胃腸外營養(yǎng)(TPN)、內(nèi)毒素、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷和手術(shù)應(yīng)激等病理?xiàng)l件下均可導(dǎo)致腸屏障功能障礙，破壞屏障的完整性，增加腸道通透性，引發(fā)腸源性感染，導(dǎo)致原發(fā)疾病加重，最終誘發(fā)機(jī)體損傷，導(dǎo)致多器官功能衰竭[4]。
　　固有免疫系統(tǒng)在一線防御中起到重要作用[5]，其主要包括上皮屏障（皮膚，粘膜上皮），可溶性分子（抗菌肽，補(bǔ)體，細(xì)胞因子和天然抗體），吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）和膜式識別受體（TLRs、NLRs、清

3、道夫受體和C型凝集素受體）。甘露糖結(jié)合凝集素(Mannose binding lectin，MBL)作為固有免疫的重要成分。其屬于凝集素超家族成員之一。其功能結(jié)構(gòu)域主要由糖基識別位點(diǎn)和膠原樣位點(diǎn)構(gòu)成。其中糖基位點(diǎn)(carbohydrate recognition domain，CRD)可以識別微生物并，再通過膠原樣位點(diǎn)(collagen like domain，CLD)與MBL相關(guān)蛋白酶(MBL-associated serine pr

4、oteases，MASPs)形成復(fù)合物進(jìn)而激活下游的補(bǔ)體途徑。此外，MBL還可以識別細(xì)胞上的受體并與吞噬細(xì)胞結(jié)合，發(fā)揮吞噬清除功能。
　　在過去十年的研究中顯示MBL與腸粘膜屏障密切相關(guān)，如在急性IBD模型中，MBL基因缺陷小鼠的腸道粘膜損傷較重，并且死亡率較高，而補(bǔ)體C3基因缺陷小鼠的腸道損傷較輕。同時(shí)在細(xì)菌侵入腸道研究中，發(fā)現(xiàn)MBL可以與細(xì)菌直接結(jié)合并清除，減少炎癥因子的釋放，從而保護(hù)腸粘膜屏障[5，6]。
　　上述研究

5、主要圍繞MBL的補(bǔ)體激活功能，而MBL的非補(bǔ)體功能研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)主要探討MBL的非補(bǔ)體依賴功能。本課題擬在體內(nèi)體外模型中，應(yīng)用免疫印記、real-timePCR、免疫熒光、跨上皮電阻測定等技術(shù)，探討內(nèi)毒素條件下MBL通過何種方式參與調(diào)控腸屏障功能，并探討其中作用機(jī)制，為MBL缺陷患者腸道保護(hù)提供新思路。
　　方法:
　　1.建立小鼠內(nèi)毒素血癥模型，應(yīng)用免疫熒光、HE染色、Ussing Chamer技術(shù)，觀察腸粘膜損傷情

6、況。
　　2.圍繞內(nèi)毒素模型，應(yīng)用免疫組化，熒光定量PCR，免疫印跡法等技術(shù)，觀察內(nèi)毒素刺激后MBL表達(dá)情況。
　　3.通過構(gòu)建MBL干擾質(zhì)粒，應(yīng)用免疫印跡法，熒光定量PCR，免疫熒光，TER等技術(shù)，觀察腸上皮屏障功能的變化情況。
　　4.體外Caco-2細(xì)胞上用MBL刺激后，檢測上皮細(xì)胞損傷以及屏障功能變化情況，明確MBL對屏障的影響。
　　結(jié)果:
　　1.LPS處理后，腸粘膜正常形態(tài)學(xué)改變，絨毛斷裂、水

7、腫，上皮細(xì)胞脫落，粘膜通透性增加，腸粘膜細(xì)胞凋亡增加。
　　2.LPS處理后，體內(nèi)和體外MBL增多，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)MBL定位在腸上皮細(xì)胞內(nèi)。
　　3.體外干擾MBL后，觀察上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin較正常組降低，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)受損，完整性差，連接中斷。并且通透性實(shí)驗(yàn)(TER)顯示腸通透性增加。低濃度重組MBL處理Caco-2細(xì)胞后，上皮細(xì)胞凋亡增加不明顯，TJ蛋白表達(dá)升高，屏障通透性降

8、低，而高濃度的重組MBL組凋亡明顯增加
　　結(jié)論：
　　1.LPS處理腸上皮細(xì)胞后，屏障通透性增加，結(jié)構(gòu)受到破壞，凋亡增加，上皮表達(dá)MBL增多。同樣在體外LPS處理腸上皮細(xì)胞后MBL表達(dá)也增多，提示MBL的表達(dá)可能在調(diào)節(jié)腸屏障功能中起到重要作用。
　　2.體外干擾MBL基因后，緊密連接蛋白表達(dá)減少，蛋白結(jié)構(gòu)改變，腸粘膜通透性增加，表明MBL可能是參與緊密連接蛋白形成的調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)腸粘膜屏障功能。而低濃度的重組MBL蛋白