腸缺血再灌注條件下腎上腺髓質(zhì)素對(duì)腸粘膜屏障功能的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　腸粘膜表面由大量腸上皮細(xì)胞構(gòu)成,在內(nèi)、外環(huán)境之間形成了一個(gè)天然保護(hù)屏障,能抵御腸腔內(nèi)的炎性因子、微生物等有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán),這個(gè)屏障就稱之為腸粘膜屏障,是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。腸缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R)發(fā)生在小腸移植、燒傷、出血、敗血癥等許多臨床相關(guān)的病理過(guò)程中,能導(dǎo)致腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞和屏障功能受損,使腸道的通透性升高,進(jìn)一步可引起腸源性感染,甚至發(fā)展為多器

2、官功能障礙綜合征,嚴(yán)重危及患者生命。因此,尋找新的有效途徑來(lái)預(yù)防和治療腸I/R的病人顯得尤為必要。
　　腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin,AM)是一種血管舒張肽,最早在人的嗜鉻細(xì)胞瘤中分離得到,其功能除了舒張血管還與增殖、凋亡關(guān)系密切。已有研究報(bào)道,AM能顯著改善腸炎引起的腸屏障功能紊亂,在腸粘膜穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮很重要的調(diào)控作用;而在腸I/R條件下,AM保護(hù)腸粘膜屏障已被認(rèn)為與其下調(diào)腸道炎癥因子密切相關(guān)[1],但是關(guān)于A

3、M是否通過(guò)腸上皮間緊密連接來(lái)發(fā)揮作用進(jìn)而影響屏障功能的文獻(xiàn)報(bào)道尚少。因此,本課題的目的主要是研究在腸I/R條件下AM對(duì)腸粘膜屏障的作用及其可能存在的機(jī)制。
　　方法:
　　1.建立腸上皮細(xì)胞株Caco-2缺氧模型以及加入AM1-52、AM22-52、CGRP8-37干預(yù)模型,用 Transwell小室對(duì)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和用電阻儀測(cè)定其跨上皮電阻(Transepithelial Resistance,TER),從而確定腸上皮

4、細(xì)胞TER在缺氧及以上幾種干預(yù)情況下的變化。
　　2.結(jié)合AM的受體阻斷劑AM22-52、CGRP8-37,通過(guò)蛋白免疫印跡和激光共聚焦技術(shù),檢測(cè)AM對(duì)腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)及結(jié)構(gòu)的影響,從而確定AM1和AM2受體在AM調(diào)控腸上皮屏障功能中具體是哪個(gè)受體發(fā)揮主要的作用。
　　3.建立小鼠腸缺血再灌注(I/R)損傷模型,通過(guò)蛋白免疫印跡、Real-time PCR及Ussing chambers技術(shù),檢測(cè)小鼠腸粘膜中A

5、M及其主要受體成分(CRLR、RAMP2、RAMP3)的表達(dá)變化和STAT1信號(hào)途徑的激活情況;以及腸道粘膜TER在I/R和AM干預(yù)情況下的變化。
　　4.在上述的體內(nèi)模型中,通過(guò)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色的方法,檢測(cè)腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)在I/R和AM干預(yù)情況下的變化。
　　主要結(jié)果:
　　1.缺氧引起腸上皮細(xì)胞TER值下降,而AM顯著改善了缺氧引起的腸上皮屏障功能損害;與此同時(shí),加入AM2

6、2-52能明顯降低AM的保護(hù)作用,然而加入CGRP8-37對(duì)AM的作用影響不大。
　　2.單純?nèi)毖蹩梢鹉c上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白Claudin-1表達(dá)下降,并且使其緊密連接的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,外源性AM作用于缺氧的Caco-2細(xì)胞,可以使Claudin-1蛋白表達(dá)重新上調(diào),其緊密連接的結(jié)構(gòu)破壞也減少;與此同時(shí),加入AM22-52和CGRP8-37對(duì)AM的影響與上述對(duì)TER的作用趨勢(shì)基本一致。
　　3.腸I/R條件下腸粘膜AM蛋白

7、含量顯著升高,術(shù)后6 h達(dá)到最高值;伴隨著腸粘膜STAT1絲氨酸殘基磷酸化(p-STAT1(S727))水平也增高;同時(shí)引起CRLR、RAMP2 mRNA水平顯著升高,而RAMP3 mRNA水平無(wú)明顯變化。
　　4.腸I/R條件下腸粘膜中的緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1在蛋白水平和mRNA水平都降低,p-STAT1(S727)被異常激活,并引起腸道TER值下降,使通透性增高;AM干預(yù)處理后顯著改善緊密連接蛋白表達(dá)的降低(

8、除ZO-1 mRNA水平無(wú)明顯變化),使激活的p-STAT1(S727)被明顯抑制,并使腸道TER值得到一定程度的升高。
　　5.HE染色鏡下可見(jiàn),I/R條件下腸粘膜中部分小腸絨毛上皮脫落,形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞;經(jīng)AM預(yù)處理使得小腸絨毛重新排列整齊,顯著緩解腸I/R所致的形態(tài)結(jié)構(gòu)損害。
　　結(jié)論:
　　I/R損傷后AM主要通過(guò)AM1(CRLR/RAMP2)受體對(duì)腸粘膜屏障起保護(hù)作用,通過(guò)調(diào)控腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá),