重組腎上腺髓質(zhì)素對(duì)大鼠皮瓣缺血再灌注的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　1、成功構(gòu)建大鼠腎上腺髓質(zhì)素真核表達(dá)質(zhì)粒(PVAX1-ADM)
　　2、探討重組腎上腺髓質(zhì)素對(duì)大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.取雄性SD大鼠腎上腺組織進(jìn)行總RNA的提取,RT-PCR方法得到ADM基因,進(jìn)行TA克隆連接到T載體上,進(jìn)一步亞克隆到pVAX1真核表達(dá)載體上,得到重組質(zhì)粒pVAX1-ADM。
　　2.雄性SD大鼠30只,體重200±10g,按體重隨機(jī)

2、分為5組,每組6只,即空載體組(pVAX1)、200μg重組質(zhì)粒組、400μg重組質(zhì)粒組、600μg重組質(zhì)粒組和800μg重組質(zhì)粒組。5組動(dòng)物皮瓣注射含重組質(zhì)粒(pVAX1-ADM)的量分別為0μg、200μg、400μg、600μg和800μg,每周1次,注射4周。取注射部位皮瓣組織,進(jìn)行RT-PCR、提蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè),以及進(jìn)行免疫組織學(xué)檢查,測(cè)定重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平,獲取重組質(zhì)粒最適注射劑量。

3、>　　3.雄性SD大鼠32只,體重200±10g,按體重隨機(jī)分為4組,每組8只,即正常對(duì)照組、缺血再灌注(IR)模型組、陽(yáng)性藥物組(維拉帕米組)、重組質(zhì)粒組。術(shù)前,重組質(zhì)粒組皮瓣注射重組質(zhì)粒600μg,其他三組注射與質(zhì)粒溶液等量的生理鹽水,每周1次,共4周。4周后進(jìn)行缺血再灌注實(shí)驗(yàn),缺血9h,再灌注12h。術(shù)中,維拉帕米組于再灌注前10分鐘,腹腔注射維拉帕米溶液2mg/kg,其他三組注射等量生理鹽水。術(shù)畢,取皮瓣組織測(cè)定MDA、SOD、

4、ET-1的含量,取血清測(cè)定CK、LDH、TNF-α的水平,及于術(shù)后7天對(duì)皮瓣組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　1.獲得的大鼠腎上腺髓質(zhì)素基因的測(cè)序結(jié)果與GeneBank中序列進(jìn)行比對(duì),完全一致。真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR后、用XbaI和HindIII雙酶切鑒定顯示,重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。分光光度法對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果為OD260/280=1.85±0.05,質(zhì)粒濃度為4.0 mg/mL。
　　2.定量RT-PCR

5、、western blot和免疫組織化學(xué)方法對(duì)注射重組質(zhì)粒的大鼠皮瓣組織進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,組織中的表達(dá)量隨重組質(zhì)粒注射量的增加而增加,但600μg與800μg組之間相差不明顯。
　　3.與 IR模型組相比,重組質(zhì)粒組皮瓣組織中 SOD的含量增加了50.67％(p﹤0.05),MDA的含量降低38.50%(p﹤0.01), ET-1的含量降低了54.73%(p﹤0.01);血清 CK的含量降低了53.84%(p﹤0.05),LDH

6、的含量降低了29.18%(p﹤0.01),TNF-α的含量降低了53.89%(p﹤0.01)。與維拉帕米組相比,重組質(zhì)粒組皮瓣組織中MDA的含量增加了8.61%(p﹥0.05),SOD的含量減少了15.84%(p﹥0.05),ET-1含量雖增加了9.53%(p﹥0.05);血清中CK的含量增加了11.93%(p﹥0.05),LDH的含量增加了33.51%(p﹤0.05),TNF-α的含量降低了18.19%(p﹥0.05)。皮瓣組織學(xué)檢查

7、結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,重組質(zhì)粒組和維拉帕米組皮瓣僅有少量壞死發(fā)生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),皮瓣水腫,間質(zhì)水腫也較對(duì)照組明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1.目的基因 ADM成功連接到真核表達(dá)載體中,提取的重組質(zhì)粒濃度為4.0 mg/mL。
　　2.重組質(zhì)粒的注入可使大鼠腹部皮瓣ADM表達(dá)量提高,其中600μg重組質(zhì)粒組為最佳劑量組,選擇應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.大鼠皮瓣組織ADM表達(dá)量提高,可以減輕脂質(zhì)過(guò)氧化,抑制氧自由基釋放