阿魏酸鈉對大鼠皮瓣缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、目的：本研究通過給大鼠腹腔內(nèi)注射阿魏酸鈉，觀察其對大鼠腹部缺血再灌注軸形皮瓣成活面積以及組織學(xué)變化的影響，觀測其對再灌注前后皮瓣組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、-氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)水平的變化，以及皮瓣內(nèi)皮細(xì)胞核因子(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)表達(dá)的影響，以探明阿魏酸鈉減輕皮瓣缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供客觀的實驗依據(jù)。
　　方法：選擇健康Wistar大鼠(雌雄不限)96只，體重3

2、00g-350g(購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組24只。A組：無缺血再灌注對照組(None-IR對照組)；B組：缺血再灌注生理鹽水對照組(NS-IR對照組)；C組：缺血再灌注組20mg/Kg阿魏酸鈉實驗組(Small-SF-IR實驗組)；D組：缺血再灌注組40mg/Kg阿魏酸鈉實驗組(Large-SF-IR實驗組)。
　　所有大鼠于術(shù)前兩天用8％硫化鈉脫毛，術(shù)時用10％水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻

3、醉。
　　NS-IR對照組，參照Petry JJ等描述的方法，充分游離腹壁淺動脈發(fā)出點(diǎn)部位的股動脈段，結(jié)扎遠(yuǎn)端的股動脈，微血管夾夾閉其發(fā)出點(diǎn)近側(cè)的股動脈，于右下腹形成一面積為3cm×6cm，以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，皮瓣形成后原位縫合。皮瓣缺血10小時后予以再灌注。并于術(shù)前再灌注前10min、再灌注后8h腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml。取8只大鼠于掀起皮瓣后即刻、再灌注后2h分別于皮瓣中段邊緣取大小約1.0cm×0.5cm全層皮瓣

4、組織織。所取組織部分用4％多聚甲醛即時固定待做HE染色石蠟切片觀察皮瓣組織的結(jié)構(gòu)變化，_以及免疫組化染色觀察NF-κB、TNF在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)情況，部分冰凍保存制作組織勻漿，生化檢測SOD、MDA、NO、ET、考馬斯亮藍(lán)蛋白(TP)。再灌注后2h已取完標(biāo)本的8只，另任取2只在冰板上，于皮瓣中央取一0.1cm×0.3cm的組織，即時用3％戊二醛固定待做透視電鏡超薄切片以觀察組織超微結(jié)構(gòu)的改變。另8只于再灌注后8h，24h同樣取材，同樣處理

5、，待檢測相同內(nèi)容。另外8只不取材，于術(shù)后7天觀察成活情況，并計算皮瓣成活率。
　　Small－SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組將分別給予腹腔注射20mg/Kg及40mg/Kg阿魏酸鈉，其余操作同NS-IR對照組。
　　None-IR對照組，皮瓣形成后原位縫合，不做其他處理，8只大鼠分別于掀起皮瓣即刻、術(shù)后12h，另8只于18h，34h用同法取材，其余操作同其他組。
　　術(shù)后第7d肉眼觀察大鼠皮瓣成活的情況

6、。通過觀察皮瓣外觀、顏色及質(zhì)地等來判斷皮瓣是否壞死。用硫酸紙描繪皮瓣壞死情況，用硫酸紙稱重法計算皮瓣成活率(皮瓣成活率=成活部分硫酸紙重量/硫酸紙總重量×100％)。
　　所有生化檢測SOD、MDA、NO、ET值均經(jīng)考馬斯亮藍(lán)蛋白校正。
　　光鏡觀察NF-κB、TNF的表達(dá)和分布部位。應(yīng)用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)軟件，每張切片隨機(jī)選擇互不重疊的5個400倍視野，測其陽性細(xì)胞的平均光度值，并計算其平均值

7、，最后整理數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。組間差異比較采用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1、皮瓣大體觀察：
　　術(shù)后7天，None-IR對照組皮瓣全部成活，末見壞死，皮瓣顏色紅潤，皮瓣無萎縮，皮瓣彈性較好，皮溫正常。NS-IR對照組，可見皮瓣中、遠(yuǎn)端大部分壞死，呈淺黑色至黑褐色，部分已結(jié)痂，彈性差，皮溫冰涼，皮瓣明顯萎縮變

8、小，掀起遠(yuǎn)端皮瓣，痂下有少許炎性分泌物。Small-SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組皮瓣壞死情況類似，皮瓣遠(yuǎn)端也出現(xiàn)部分壞死，但面積較NS-IR對照組小，皮瓣近端顏色淡紅，質(zhì)地柔軟，遠(yuǎn)端呈黑褐色，質(zhì)地變硬，彈性差?？梢?，None-IR對照組皮瓣成活情況明顯好于另外三組；而Small-SF-IR實驗組，Large-SF-IR實驗組均優(yōu)于NS-IR對照組。Large-SF-IR實驗組略好于Small-SF-IR實驗組。

9、　　2、皮瓣成活率：
　　None-IR組(100％±0.00)Large-SF-IR實驗組(81.2±4.3％)>Small-SF-IR實驗組(67.4±5.2％)>NS-IR對照組(36.3±4.5％)，Small-SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組與NS-IR對照組均有顯著性差異(P<0.05)，Large-SF-IR實驗組與Small-SF-IR實驗組也有顯著性差異(P<0.05)。
　　3、實驗室檢查結(jié)

10、果：
　　3.1 HE染色切片光學(xué)顯微鏡觀察：
　　None-IR對照組各時段皮瓣各層組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核深染，無明顯炎性水腫。NS-IR對照組：再灌注后2h，少量嗜中性粒細(xì)胞浸潤；再灌注后8h皮下組織水腫加重，組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，大量嗜中性粒細(xì)胞粘附于血管壁，微血管壁完整性破壞；再灌注后24h情況進(jìn)一步加重，大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤至組織間隙，皮瓣各層組織結(jié)構(gòu)模糊不清，部分肌纖維壞死。Small-SF-IR實驗組與Large-S

11、F-IR實驗組各時段情況均較NS-IR對照組輕微，24h情況較前有好轉(zhuǎn)，但仍有大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤。
　　3.2超薄切片透射電鏡觀察：
　　None-IR組可見皮瓣內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，可見線粒體嵴，嵴與膜結(jié)構(gòu)尚清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)見少量脫顆?，F(xiàn)象。Small－SF-IR實驗組與Large-SF-IR實驗組可見線粒體，部分線粒體嵴消失，與膜融合，基底細(xì)胞與基底細(xì)胞之間可見橋粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒現(xiàn)象。NS-IR對照組：可見內(nèi)皮細(xì)胞破壞嚴(yán)重

12、，線粒體嵴與膜融合，結(jié)構(gòu)模糊不清，部分嵴斷裂與缺失。
　　3.3、MDA檢查結(jié)果：
　　掀起皮瓣后即刻四組MDA的含量均約3.2nmol/mgp左右，無顯著性差異(P>0.05)。再灌注后2h，8h，24h，各點(diǎn)MDA值隨著再灌注時間延長而升高，各均值呈現(xiàn)：NS-IR對照組>Small-SF-IR實驗組>Large-SF-IR實驗組>None-IR組。各組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。
　　3.4、SOD檢

13、查結(jié)果：
　　掀起皮瓣后即刻四組SOD的含量均約80.5U/mgp左右，無顯著性差異(P>0.05)，再灌注后2h，8h，24h，各點(diǎn)值均呈現(xiàn)：None-IR組>Large-SF-IR實驗組>Small-SF-IR實驗組>NS-IR對照組，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。
　　3.5、ET檢查結(jié)果：
　　掀起皮瓣后即刻四組ET的含量均約18.2pg/mgp左右，無顯著性差異(P>0.05)，再灌注后2h

14、，8h，24h，各點(diǎn)MDA值均呈現(xiàn)：NS-IR對照組>Small－SF-IR實驗組>Large-SF-IR實驗組>None-IR組。各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。
　　3.6、NO檢查結(jié)果：
　　掀起皮瓣后即刻四組ET的含量均約6.65nmol/mgp左右，無顯著性差異(P>0.05)，再灌注后2h，8h，24h，各點(diǎn)值均呈現(xiàn)：None-IR組>Large-SF-IR實驗組>Small－SF-IR實驗組>N

15、S-IR對照組，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。
　　3.7、核因子(NF－κB)檢查結(jié)果：
　　NF-κB主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)，掀起皮瓣后即刻四組均末見NF-κB陽性細(xì)胞，None-IR組術(shù)后各時間點(diǎn)陽性表達(dá)均較弱。Small－SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組和NS-IR對照組在再灌注后2h，8h，24可見大量的NF-κB陽性細(xì)胞，NS-IR對照組再灌注后2h表達(dá)最強(qiáng)，Small

16、-SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組再灌注后8h表達(dá)最強(qiáng)。各點(diǎn)NS-IR對照組>Small-SF-IR實驗組>Large-SF-IR實驗組>None-IR組(P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。
　　3.8、腫瘤壞死因子(TNF-a)檢查結(jié)果：
　　TNF-a主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，掀起皮瓣即刻四組均偶見血管內(nèi)皮細(xì)胞有極少量TNF-a陽性細(xì)胞表達(dá)，但量較小，無法定量。None-IR組術(shù)后各時間點(diǎn)陽性表達(dá)均較弱。S

17、mall-SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組和NS-IR對照組在再灌注后2h，8h，24可見大量的TNF-a陽性細(xì)胞，NS-IR對照組再灌注后2h表達(dá)最強(qiáng)，Small-SF-IR實驗組、Large-SF-IR實驗組再灌注后8h表達(dá)最強(qiáng)。各點(diǎn)NS-IR對照組>Small-SF-IR實驗組>Large-SF-IR實驗組>None-IR組(P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。
　　結(jié)論：
　　1.阿魏酸鈉可能通過抑制內(nèi)