缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷的保護作用及miRNA相關機制研究.pdf

1、背景：游離皮瓣移植（Free Skin Flap Grafting，SGF）是整形外科修復組織缺損畸形和器官再造的重要手段和方法。缺血再灌注（Ischemic Reperfusion，I/R）是組織游離移植過程中不可避免的病理過程，在對發(fā)生血管危象皮瓣進行探查及二次吻合的過程中，缺血再灌注損傷更為常見，嚴重影響皮瓣的成活率和存活質量。在缺血再灌注損傷治療研究領域，缺血后處理（Ischemic Postconditioning，IPo）和

2、遠程缺血后處理（Remote Ischemic Postconditioning，RIPo）是目前基礎及臨床工作關注的熱點。在對心、腦、脊髓、肺、腎等再灌注模型的研究中，IPo及RIPo對組織缺血再灌注損傷的保護作用逐漸被證實，部分的研究成果已被應用于臨床缺血再灌注的預防和治療，但其具體的作用機制至今尚不清晰。miR-21是近年來被發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷過程中具有重要保護作用的miRNA。既往研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導因子-1a（Hypoxia

3、 Inducible Factor-1a，Hif-1a）能夠在缺氧早期促進細胞內miR-21表達，后者能夠通過靶向抑制其下游的促凋亡基因起到抑制細胞凋亡的作用。
　　目的：本研究擬通過構建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型，探討原位缺血后處理和遠程肢體缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷的保護作用，以及對Hif-1a蛋白和一系列組織缺氧相關miRNA的表達調控。在體外實驗中，研究擬采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H202）作為

4、外源性自由基生成系統(tǒng)，建立體外血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）氧化應激損傷模型，探討miR-21過表達對VSMC在氧化損傷中的抗凋亡作用，及其對凋亡誘導蛋白PTEN的表達調控。同時，通過對臨床游離皮瓣缺血及再灌注組織樣本的檢測，研究擬進一步明確miRNA表達與人體皮瓣缺血再灌注損傷的相關性。
　　方法：1.構建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型：①設計以腹壁淺動脈為蒂的大鼠腹壁島狀瓣模

5、型，按缺血時間（0小時，4小時，6小時，8小時，12小時）將50只SD大鼠隨機分為5組；②硫代巴比妥酸法再灌注24小時檢測各組皮瓣組織中丙二醛（MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法檢測各組皮瓣組織中氧化物歧化酶（SOD）活性；③再灌注第7天分析皮瓣成活區(qū)域和壞死區(qū)域面積，計算皮瓣存活率；④實時逆轉錄聚合酶鏈式反應（real-time RT-PCR）檢測缺血8小時，再灌注2小時，再灌注12小時，再灌注24小時，Rno-miR-1，Rno-miR-

6、133，Rno-miR-210，Rno-miR-21，Rno-miR-200c及 Rno-miR-92a在大鼠皮瓣及血管組織內的表達；2.體內研究缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷的保護作用：①設計以腹壁淺動脈為蒂的大鼠腹壁島狀瓣缺血再灌注模型，將40只SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組），對照組（NC組），缺血后處理組（Isc組），遠程肢體缺血后處理組（Rem-Isc組），每組10只；②硫代巴比妥酸法檢測再灌注24小時各組皮瓣組織MDA

7、含量，黃嘌呤氧化酶法檢測各組皮瓣組織SOD活性；③免疫組化法（IHC）檢測再灌注第3天各組皮瓣組織內Hif-1a蛋白表達；④免疫印跡法（Western Blot）檢測再灌注第3天及第7天血管組織內Hif-1a蛋白表達；⑤實時逆轉錄聚合酶鏈式反應（real-time RT-PCR）檢測再灌注2小時，再灌注12小時，再灌注24小時，Rno-miR-21及 Rno-200c在大鼠皮瓣及血管組織內的表達；⑥再灌注第7天對大鼠皮瓣進行拍攝，測量各

8、組皮瓣成活區(qū)域和壞死區(qū)域面積，計算皮瓣存活率；3.體外研究miR-21對血管平滑肌細胞氧化損傷的保護作用：①組織貼塊法培養(yǎng)原代大鼠動脈血管平滑肌細胞（VSMC），免疫熒光鑒定平滑肌標志蛋白 a-Actin表達，體外構建過氧化氫（H202）誘導的細胞氧化損傷模型；②通過 lipofectine2000?脂質體轉染 miR-21模擬物以及miR-21抑制劑，在VSMC內過表達miR-21或抑制miR-21表達；實驗隨機分組：NC組；H202

9、組；miR-21 mimics+ H202組；NC1 mimics+ H202組； miR-21 inhibitor+H202組；NC2+H202組；miR-21 mimics組；NC1 mimics組；miR-21 inhibitor組；miR-21 inhibitor組；③ CCK-8法檢測VSMCs處理后24小時和48小時細胞活力；④ Western Blot檢測處理后48小時各組細胞內PTEN蛋白、Pre-CASP3蛋白以及cl

10、eaved-CASP3蛋白表達;⑤免疫熒光鑒定VSMCs處理后24小時細胞內a-Actin蛋白表達；⑥ PI/HO染色鑒定VSMCs處理后24小時細胞凋亡率；4.游離皮瓣乳房重建術患者相關數據分析：①分別于術前及術后6月對126名游離皮瓣乳房重建患者進行 RSES、PHQ-9、GAD-7等自我評估量表檢測，并對結果進行比較分析；②術中采集6名行游離腹壁下動脈穿支皮瓣（DIEP）乳房重建術患者的正常（N組）、缺血（I組）及再灌注后（R組）

11、DIEP皮瓣邊緣組織樣本，real-time RT-PCR檢測組織中miR-210，miR-21，miR-200c及miR-92a相對表達。
　　結果：1.構建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型：①術后第7天，缺血0小時組、4小時組、6小時組、8小時組、12小時組的皮瓣存活面積依次為98.1±1.6%、92.6±7.4%、87.1±14.0%、54.6±13.4%、24.2±11.1%。方差分析結果顯示，各組皮瓣存活面積具有顯著性差異（P

12、<0.05）；②再灌注24小時各組皮瓣組織內MDA含量依次為38.0±5.8 nmol/g、72.9±17.0 nmol/g、103.8±10.9 nmol/g、171.7±4.7 nmol/g、165.1±10.5 nmol/g，皮瓣組織中 SOD活性依次為93.2±12.8 U/g、76.9±9.9 U/g、56.7±7.3 U/g、37.6±6.0 U/g、26.1±6.5 U/g；方差分析結果顯示，各組皮瓣組織中MDA含量及SO

13、D活性均具有顯著性差異（P<0.05）；③與缺血前相比，血管組織及皮瓣組織內 Rno-miR-21和Rno-miR-200c在缺血再灌注再灌注2小時，再灌注12小時，再灌注24小時，表達均顯著升高；2.缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷保護作用的體內研究：①與NC組相比，Isc組與Rem-Isc組再灌注第7天皮瓣存活面積顯著升高（P=0.034，P=0.049）；②與NC組相比，Isc組與Rem-Isc組再灌注24小時皮瓣組織內MDA含量顯

14、著下降（P=0.011，P=0.014），SOD活性顯著升高（P=0.020，P<0.01）；③免疫組化結果顯示，與NC組相比，Isc組與Rem-Isc組再灌注第3天皮瓣組織內Hif-1a蛋白陽性表達顯著升高；④ Western Blot結果顯示再灌注第3天與第7天，Isc組皮瓣血管組織Hif-1a蛋白表達與NC組相比均顯著升高（P<0.01，P<0.01）；Rem-Isc組皮瓣血管組織Hif-1a蛋白表達與NC組相比均顯著升高（P<0

15、.01，P<0.01）；⑤與NC組相比，再灌注24小時內，Isc組與Rem-Isc組皮瓣組織及血管蒂組織內Rno-miR-21表達均顯著升高；與NC組相比，Isc組血管蒂組織內Rno-miR-200c僅在再灌注12小時后表達上調，Rem-Isc組則無明顯改變；3.體外研究 miR-21對血管平滑肌細胞氧化損傷的保護作用：①與NC組相比，H202組VSMC細胞內α-actin蛋白表達顯著減少（P<0.01）；與NC1+H202組比較，mi

16、R-21 mimics+H202組VSMC細胞內α-actin蛋白表達呈一定程度的升高趨勢，但差異無顯著性（P=0.073）；與NC2+H202組比較，miR-21 inhibitor+H202組VSMC細胞內α-actin蛋白表達量顯著下降（P=0.049）；② Western blot結果顯示，與NC組相比，H202組VSMC細胞Pro-CASP3、cleaved CASP3蛋白表達顯著增高（P=0.011，P<0.01），PTEN

17、蛋白表達量下降（P=0.028）；與NC1+H202組比較，miR-21 mimics+H202組細胞內PTEN蛋白表達量顯著下降（P<0.01），Pro-CASP3蛋白表達無明顯改變，cleaved CASP3蛋白表達顯著降低（P=0.014）；與NC2+ H202組比較，miR-21 inhibitor+ H202組VSMC細胞內PTEN蛋白表達量顯著增加（P<0.01），Pro-CASP3蛋白表達無明顯改變，cleaved CAS

18、P3蛋白表達顯著增高（P=0.027）；③ CCK-8結果顯示：H202組細胞培養(yǎng)孔450 nm24小時與48小時OD值均顯著低于NC組（P<0.01，P<0.01）；miR-21mimics+H202組在24小時與NC1 mimics+H202組相比450 nm OD值沒有顯著改變，48小時OD值較NC1 mimics+H202組顯著增高（P=0.013）；miR-21 inhibitor+H202組在24小時與NC2 inhibit

19、or+H202組相比450 nm OD值沒有顯著改變，48小時OD值較NC2 inhibitor+H202組顯著降低（P=0.016）；⑤與NC組相比，H202組VSMC細胞核PI染色比例顯著升高（P<0.01）；與NC1+H202組比較，miR-21 mimics+H202組VSMC細胞核PI染色比例顯著下降（P=0.048）；4.游離皮瓣乳房重建患者臨床數據分析：①與術前相比，游離皮瓣乳房重建術后患者平均RSES評分顯著升高（P<0

20、.01），PHQ-9平均評分顯著降低（P<0.01），GAD-7平均評分無明顯改變；②術后6個月隨訪結果提示，DIEP游離皮瓣乳房重建患者Alderman滿意度評分為27.6±6.3分，切術后RSES評分（P<0.01）、術后RESE評分改變值（P<0.01）、術后GAD-7評分（P<0.01）以及術后GAD-7評分改變值（P<0.01）與Alderman評分線性相關；③與正常皮瓣組織相比，缺血90分鐘后人體皮瓣組織中 miR-21，m

21、iR-210，miR-92a、miR-200c的表達均無顯著性差異；與正常皮瓣組織相比，再灌注90分鐘后皮瓣組織中miR-21(P=0.02)，miR-200c(P=0.03)表達顯著上調，miR-210，miR-92a表達無顯著性差異。
　　結論：①缺血后處理和遠程肢體缺血后處理能夠減輕缺血再灌注后氧自由基對皮瓣的損傷，增加缺血后皮瓣存活面積；② Hif-1蛋白表達及miR-21的表達上調可能參與了缺血后處理和遠程肢體缺血后處理