水蛭素對島狀皮瓣缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：通過制作大鼠腹部皮瓣缺血再灌注(ischemia-reperfusion I-R)損傷模型，并給予不同濃度的天然水蛭素(Hirudin)進行干預(yù)，觀察其對皮瓣成活面積及組織形態(tài)變化的影響，以期證實水蛭素防止島狀皮瓣缺血再灌注損傷的作用；應(yīng)用生物化學及免疫組化方法，測定皮瓣組織中內(nèi)皮素(endothelin，ET)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和核轉(zhuǎn)

2、錄因子(NF)-κ B、腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量，觀察其變化規(guī)律，進一步探討水蛭素的作用機制，為解決皮瓣移植術(shù)后因缺血再灌注損傷而導(dǎo)致皮瓣成活率減低這一難題提供新方法及客觀的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1實驗動物：雄性健康Wistar大鼠116只，體重，(300±20)g，河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供，稱重、編號。
　　2動物分組：將大鼠隨機分為：非缺血再灌注(非 IR)組、缺血再灌注(IR)組、天然水蛭素0.

3、5mg/kg組(H0.5組)、天然水蛭素1.0mg/kg組(H1.0組)4組，各29只。每組大鼠除8只用于測定皮瓣成活率，1只用于留取電鏡標本外，剩余20只再按手術(shù)時間隨機分為術(shù)后即刻、8h、10h、16h、32h五個亞組。
　　3模型制備：于右腹部設(shè)計6.0cm×3.0cm島狀皮瓣，皮瓣長軸與大鼠長軸平行，以腹壁淺血管為蒂，以腹正中線為內(nèi)側(cè)邊，下達腹股溝水平，深至皮下肉膜層。非－IR組：切開后原位縫合，不做任何處理；其余三組：縫

4、扎腹壁淺動脈發(fā)出點遠端股動脈，切斷除腹壁淺血管外其他分支，血管夾夾閉發(fā)出點近端股動脈，皮瓣原位縫合。持續(xù)缺血8h后取出動脈夾，確認血管再通。
　　4給藥：非IR組不用藥，IR組、H0.5組及H1.0組大鼠自術(shù)前一天起分別向皮下注射生理鹽水、0.5mg/kg及1.0mg/kg天然水蛭素注射液，每8h一次，給藥體積均為0.5ml，給藥位置均在皮瓣正下方。
　　5取材：各實驗組所分亞組內(nèi)的4只大鼠按分組時間分別于皮瓣中段近中心處取

5、1.0cm×0.5cm×0.2cm全層皮瓣組織兩塊；每塊組織均分為兩份，一份用于生化檢查，另一份制作石蠟切片。術(shù)后16h(再灌注后8h)亞組內(nèi)余下一只大鼠在同樣位置取1.0mm×2.0mm×2.0mm全層皮瓣組織，用于透射電鏡觀察。
　　6觀測指標：
　　6.1皮瓣成活率：術(shù)后第7天觀察各組大鼠腹部皮瓣成活情況，以皮瓣淡紅色，質(zhì)地柔軟，毛發(fā)恢復(fù)生長為成活；以皮瓣變硬，顏色轉(zhuǎn)黑、結(jié)痂為壞死標準。用數(shù)碼相機對各組皮瓣拍照并輸入計

6、算機，通過Image-ProPlus.v6.0圖形分析系統(tǒng)計算皮瓣成活面積占總面積的百分比。
　　6.2組織學觀察：(1)光鏡觀察：部分石蠟切片進行HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)變化；(2)透射電鏡觀察：電鏡標本用3％戊二醛固定3h，1％鋨酸固定1h，常規(guī)脫水、包埋，制作超薄切片觀察基底細胞線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的改變。
　　6.3生化檢測：所取另一部分標本制成10％組織勻漿，按照試劑盒說明測定ET、MDA含量及SOD活性；
　　

7、6.4免疫組化檢測：部分石蠟切片進行免疫組化染色，每亞組任選8張切片，每張切片隨機選5個互不重疊分割區(qū)，利用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)檢測NF-κ B、TNF-α陽性細胞的表達并計數(shù)。
　　7統(tǒng)計學處理：用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，有顯著差異者進行SNK-q檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1皮瓣成活情況；術(shù)后7天，IR組大鼠皮瓣

8、大面積壞死，顏色變黑，質(zhì)地變硬，皮瓣回縮，表面痂殼形成，切開后未見明顯出血，肉膜下分泌物較多；H0.5組及H1.0組皮瓣大部分成活良好，近、中段皮瓣顏色淡紅，彈性較好，表面可見少量毛發(fā)生長，遠端部分皮瓣顏色逐漸加深，表面散在黑色痂皮，易剝脫，切開后可見少量滲血。肉膜下僅少量分泌物；非 IR組皮瓣呈淡紅色，彈性良好，毛發(fā)生長均勻，幾乎全部成活。
　　皮瓣存活率：非IR組(98.00±1.08)%>H0.5組(65.32±3.33)％

9、及H1.0組(70.52±4.93)％>IR組(38.47±5.42)％，除H0.5組及H1.0組無顯著性差異(P>0.05)外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=82.20，P<0.01)。
　　2形態(tài)學觀察：
　　(1)HE染色：非 IR組各時段皮瓣各層結(jié)構(gòu)完整。毛細血管輕度擴張，炎癥細胞少量浸潤，纖維結(jié)締組織排列規(guī)整，皮脂腺分泌旺盛，無壞死表現(xiàn)。IR組缺血后8h表皮增厚，細胞水腫，微血管擴張，部分管壁連續(xù)性中斷；再灌注

10、后8小時損傷進一步加重，表皮萎縮，層次不清，連續(xù)性中斷，真皮內(nèi)大量炎性細胞浸潤，部分毛細血管閉塞，呈現(xiàn)不可逆性損傷。H0.5組及H1.0組缺血后8h細胞輕度水腫，真皮內(nèi)少量炎性細胞聚集；再灌注后8h表皮局部進行性增厚，毛細血管數(shù)量增多，少數(shù)毛細血管內(nèi)可見血栓形成，結(jié)締組織排列疏松。
　　(2)透射電鏡觀察：術(shù)后16小時，非IR組基底細胞內(nèi)可見大量線粒體，細胞器結(jié)構(gòu)完整；IR組基底細胞高度水腫，線粒體嵴減少或缺失，結(jié)構(gòu)不清。粗面內(nèi)質(zhì)

11、網(wǎng)擴張，可見顆粒融合及脫顆粒現(xiàn)象，損傷嚴重；H0.5組及H1.0組基底細胞超微結(jié)構(gòu)改變程度均較IR組輕，線粒體輕度腫脹，少部分嵴與膜融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，周圍可見大量游離的多聚核糖體，相鄰細胞間可見橋粒連接。
　　3.生化檢測：
　　3.1 ET值：術(shù)后即刻各組ET值約在35.06pg/ml左右，差異無統(tǒng)計學意義(F＝0.50，P>0.05)，術(shù)后8h、10h、16h、32hET值逐漸升高，表現(xiàn)為I R組>H0.5組及H

12、1.0組>非IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3.2 SOD值：術(shù)后即刻SOD值表現(xiàn)為：H0.5組>H1.0組>非IR及I R組，非IR組與IR組無顯著差異(P>0.05)，其余各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。術(shù)后8h，10h，16h，32hSOD活性逐漸下降，組間比較：H0.5組>H1.0組>非IR組>I R組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3.3 MDA值：術(shù)后即刻各組MDA值約在2.5-

13、3.0nmol/mgprot間，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.80，P>0.05)。術(shù)后8h，10h，16h，32h四組樣本MDA值逐漸增高，表現(xiàn)為：I R組>H0.5組及H1.0組>非IR組，兩兩比較除H0.5組與H1.0組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各兩組間均有顯著差異(P<0.01)。
　　4免疫組化檢測：在術(shù)后即刻TNF－α及NF-κ B表達量極少，測定結(jié)果誤差較大，故不計入統(tǒng)計學分析。缺血再灌注期間，各組樣本基底

14、細胞、毛囊、汗腺、血管內(nèi)皮細胞以及粒細胞內(nèi)均可見不同程度TNF-α及NF－κ B表達，其中TNF-α表達主要集中于血管內(nèi)皮細胞，NF－κ B表達集中在基底細胞和血管內(nèi)皮細胞。TNF-α及NF-κ B平均OD值隨時間延長逐漸增加，且均表現(xiàn)為：I R組>H0.5組及H1.0組>非IR組。兩兩比較除H0.5組與H1.0組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各兩組間均有顯著差異(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1水蛭素通過抑制