磷酸化HSP27保護(hù)燒傷血清刺激條件下血管內(nèi)皮屏障的作用與機(jī)制研究.pdf

1、血管通透性增高是燒傷早期休克和臟器水腫的根本原因，其本質(zhì)是血管內(nèi)皮屏障通透性的增高，從而導(dǎo)致早期血管內(nèi)液大量外滲，引發(fā)全身組織灌注減少和組織器官水腫。由于燒傷早期血管通透性增高機(jī)制尚未得到充分證實(shí)，目前臨床上缺少有效的防治措施。因此，深入揭示燒傷后微血管通透性變化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，研究防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略，具有重要的理論價值和臨床意義。
　　內(nèi)皮細(xì)胞回縮是多種病理生理（包括燒傷）條件下內(nèi)皮細(xì)胞間裂隙形成、微血管通透性增

2、高的重要基礎(chǔ)。以往認(rèn)為，應(yīng)力纖維中F-actin與肌球蛋白相互作用，產(chǎn)生向心收縮力，是內(nèi)皮細(xì)胞回縮的骨架基礎(chǔ)，而HSP27磷酸化則是應(yīng)力纖維形成的重要分子機(jī)制。然而，最近有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化HSP27通過促進(jìn)應(yīng)力纖維形成或保護(hù)F-actin骨架，顯著降低了缺氧或急性炎癥等條件下血管內(nèi)皮通透性。
　　p38激酶/MK2是HSP27磷酸化的關(guān)鍵信號途徑。我們以往發(fā)現(xiàn)，燒傷后血管內(nèi)皮通透性增高并不與應(yīng)力纖維形成相平行。燒傷后內(nèi)皮細(xì)胞F-a

3、ctin骨架發(fā)生了復(fù)雜變化，即:早期形成應(yīng)力纖維，后期F-actin破壞、解聚或排列紊亂。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞HSP27磷酸化水平僅短暫升高。鑒于磷酸化HSP27降低血管通透性作用的相關(guān)認(rèn)識，我們推測，p38激酶-HSP27磷酸化很可能是燒傷后血管內(nèi)皮屏障的重要保護(hù)性適應(yīng)機(jī)制，只是隨著時間延長，促通透性因素的級聯(lián)放大，p38激酶-HSP27磷酸化這一保護(hù)性適應(yīng)機(jī)制不斷削弱，使得血管通透性增高。
　　本

4、項(xiàng)目提出HSP27磷酸化是燒傷后血管內(nèi)皮屏障的重要保護(hù)性適應(yīng)機(jī)制的假設(shè)。擬以燒傷患者血清為刺激因素，以大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞為對象，采用基因突變技術(shù)構(gòu)建磷酸化和非磷酸化HSP27表達(dá)突變體，探討HSP27的磷酸化狀態(tài)與燒傷血清刺激條件下肺血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成和通透性變化的關(guān)系;從蛋白磷酸酶PP2A調(diào)節(jié)HSP27去磷酸化和SUMO化修飾對MK2活性的抑制作用兩方面，初步明確HSP27磷酸化隨時間削弱的分子機(jī)制。研究對深入揭示燒傷后微血管通

5、透性變化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，從細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)角度促成防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略，具有重要意義。
　　研究目的：
　　探討磷酸化HSP27在燒傷血清刺激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性變化中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究內(nèi)容：
　　1.HSP27磷酸化、蛋白表達(dá)和分布與內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成、通透性變化關(guān)系的研究
　　2.HSP27磷酸化在燒傷血清刺激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性變化中的作用
　　3.PP2A與MK2的SUM

6、O化修飾對HSP27磷酸化的調(diào)節(jié)作用研究
　　研究方法：
　　1.按常規(guī)方法收集嚴(yán)重?zé)齻颊哐澹ㄉ疃群腿葻齻娣e＞50％的患者）
　　2.培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用Transwell小室建立單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用跨單層?nèi)皮細(xì)胞電阻法(TEER)評估內(nèi)皮單層通透性變化。
　　3.采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色技術(shù)觀察內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1、F-actin形態(tài)分布變化;采用Image J軟件計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞間隙和

7、細(xì)胞表面積變化。
　　4.采用Western blot技術(shù)檢測燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞p38激酶、MK2和HSP27磷酸化水平以及MK2的SUMO化修飾。
　　5.構(gòu)建磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞。
　　6.采用OA抑制PP2A和轉(zhuǎn)染SENP1腺病毒抑制MK2的SUMO化修飾，探討PP2A去磷酸化作用和SUMO化修飾抑制MK2活性對HSP27磷酸化的調(diào)節(jié)作用。
　　研究

8、結(jié)果與結(jié)論：
　　1.燒傷血清刺激1h，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增強(qiáng)，隨著刺激時間延長，通透性進(jìn)一步增強(qiáng);同時，細(xì)胞間緊密連接完整性破壞，伴細(xì)胞間裂隙增加和細(xì)胞表面積縮小。
　　2.燒傷血清刺激0.5h，內(nèi)皮細(xì)胞中央型F-actin應(yīng)力纖維形成增多;隨著刺激時間延長，中央型F-actin應(yīng)力纖維消失，代之以不規(guī)則的細(xì)胞周邊型F-actin形成增多。
　　3.燒傷血清使p38 MAPK-MK2-HSP27信號通路激活;

9、其中，p38 MAPK/MK2呈持續(xù)活化，而HSP27磷酸化僅在燒傷血清刺激0.5h時大幅增強(qiáng)，隨后迅速回落。HSP27磷酸化瞬時增強(qiáng)與內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成時間相吻合，二者高峰均出現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高之前。
　　4.構(gòu)建的磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表達(dá)載體能有效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞并高表達(dá)目的蛋白。較之非磷酸化HSP27和空載體轉(zhuǎn)染對照組，磷酸化HSP27轉(zhuǎn)染能顯著抑制燒傷血清導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，使細(xì)胞中央型F-ac

10、tin應(yīng)力纖維形成增多。此外，磷酸化HSP27可以部分對抗細(xì)胞松弛素D導(dǎo)致的內(nèi)皮通透性增高。
　　5.內(nèi)皮細(xì)胞PP2A可與HSP27發(fā)生相互作用，且這一作用在燒傷血清刺激條件下進(jìn)一步增強(qiáng)，抑制PP2A可使燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞HSP27磷酸化部分增強(qiáng)。內(nèi)皮細(xì)胞中MK2存在SUMO化修飾，且該修飾作用在燒傷血清刺激條件下進(jìn)一步增強(qiáng)。高表達(dá)SENP1可顯著解除SUMO蛋白對MK2活性的抑制作用，使HSP27的磷酸化水平升高。