Src磷酸化參與低劑量鉛暴露致大腦屏障損傷及其轉(zhuǎn)運的機(jī)制研究.pdf

1、背景:鉛是一種廣泛分布的環(huán)境污染物。鉛暴露可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列中樞神經(jīng)毒性效應(yīng)，包括智商的降低、認(rèn)知缺陷、注意力渙散以及攻擊行為的增加等。發(fā)育期的大腦屏障是鉛神經(jīng)毒性的重要靶點之一，主要包括血腦屏障（BBB）和血腦脊液屏障（BCB）。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接（TJ）、星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足、基膜和周細(xì)胞是BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的TJ構(gòu)成了BCB。以往研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露可以引起B(yǎng)BB和BCB緊密連接蛋白（TJPs）表達(dá)水

2、平下降，導(dǎo)致TJ結(jié)構(gòu)的破壞和屏障通透性的增高。然而，鉛暴露導(dǎo)致TJPs水平降低的機(jī)制目前尚不清楚。鉛進(jìn)入腦實質(zhì)或者腦脊液的途徑尚未完全揭示，已知鉛入腦的主要途徑有兩種：一是破壞TJ后從細(xì)胞間的區(qū)域穿過，二是通過大腦屏障細(xì)胞上的鉛轉(zhuǎn)運體蛋白或轉(zhuǎn)運通道攝入。Connexin43（Cx43）是BBB和BCB中表達(dá)最為廣泛的縫隙連接（GJ）分子，Cx43半孔道近來被發(fā)現(xiàn)是多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運孔道。既往文獻(xiàn)顯示，鉛暴露可引起海馬腦區(qū) Cx43的表達(dá)增高

3、，而海馬是腦內(nèi)鉛蓄積的重要部位，提示Cx43半孔道可能具有轉(zhuǎn)運鉛的功能。Src是非受體型蛋白酪氨酸激酶，可在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)界面的粘著復(fù)合體上介導(dǎo)整合素的信號。Src激酶的活性對于上皮細(xì)胞TJPs的組裝和降解都至關(guān)重要。而且，Src還可直接與Cx43相互作用，并通過磷酸化 Cx43來降低 GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊（GJIC）、引起GJ的降解和孔道的關(guān)閉。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：鉛暴露大鼠大腦微血管組織中Src磷酸化顯著上調(diào)，且增高幅度高于其他

4、蛋白激酶。
　　目的:本課題的研究目的在于明確：（1）鉛暴露是否通過Src激酶途徑改變BBB與BCB的 TJ蛋白的表達(dá)；（2）Cx43在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中攝取鉛的作用；（3）Src磷酸化是否參與調(diào)控Cx43的表達(dá)及細(xì)胞的鉛蓄積。
　　方法:
　　1．以大鼠大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系（RBE4）和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系（Z310）作為研究對象，分別建立BBB和 BCB的體外模型。采用原子吸收分光光度法檢測細(xì)胞鉛吸收量

5、。
　　2．Western blot法檢測細(xì)胞P-Src、C-Src、GRP78、Cx43等蛋白表達(dá)水平的變化。qRT-PCR技術(shù)檢測GRP78、Cx43等分子的mRNA水平。
　　3．免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測 GRP78、Cx43在細(xì)胞中的分布，免疫電鏡、生物素標(biāo)記活細(xì)胞膜蛋白等技術(shù)檢測RBE4細(xì)胞中GRP78定位和分布的變化。
　　4．采用溴化乙錠（EthBr）攝取實驗檢測細(xì)胞Cx43半孔道的吸收功能。
　　5．采

6、用siRNA干涉技術(shù)抑制GRP78的表達(dá)水平，觀察其對Src、occludin和ZO-1等蛋白表達(dá)的影響。使用Src信號通路阻斷劑，檢測抑制Src磷酸化對GRP78、Cx43、occludin和ZO-1等蛋白表達(dá)的影響。
　　6．基于Z310細(xì)胞構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系iZCx43，實現(xiàn)可控的四環(huán)素誘導(dǎo)Cx43高表達(dá)，原子吸收分光光度法檢測Cx43表達(dá)變化對細(xì)胞鉛吸收的影響。
　　結(jié)果:
　　1．鉛處理RBE4和Z310細(xì)

7、胞24 h后，Src的磷酸化均顯著增加，但是其上游分子 GRP78僅在 RBE4細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)。阻斷 Src的磷酸化可逆轉(zhuǎn)鉛暴露所引起occludin水平的降低，但對ZO-1則無此作用。
　　2．在RBE4細(xì)胞中，GRP78 siRNA干涉可減弱鉛所誘導(dǎo)的Src磷酸化和occludin水平的降低。免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)鉛暴露能夠引起GRP78蛋白的分布范圍從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜擴(kuò)散。中和抗體封閉膜表面GRP78未能引起Src磷酸化的逆

8、轉(zhuǎn)，提示細(xì)胞質(zhì)GRP78，而非膜表面GRP78，參與鉛激活Src磷酸化及隨后occludin水平的降低。
　　3．鉛暴露可上調(diào)RBE4細(xì)胞Cx43的蛋白水平，下調(diào)Z310細(xì)胞Cx43的蛋白水平，而RBE4細(xì)胞蓄積鉛的能力高于Z310細(xì)胞，說明Cx43的上調(diào)能增加RBE4細(xì)胞的鉛吸收量，而它的下調(diào)則限制Z310細(xì)胞的鉛吸收。降低培養(yǎng)基中的血清濃度可誘導(dǎo)Cx43半孔道開放，同時細(xì)胞的鉛吸收也顯著增加。Cx43介導(dǎo)的鉛吸收可被Cx43的

9、半孔道抑制劑顯著阻斷。瞬時過表達(dá)Cx43可引起細(xì)胞鉛吸收量的增加。以四環(huán)素誘導(dǎo)iZCx43細(xì)胞Cx43表達(dá)增高后，細(xì)胞的鉛吸收量也顯著增加。
　　4．在RBE4細(xì)胞中，Src通路的激活參與鉛暴露致Cx43的上調(diào)，提示鉛暴露可能通過促進(jìn)Src磷酸化而增加細(xì)胞的鉛吸收；而在Z310細(xì)胞中，鉛暴露可誘導(dǎo)Src通路激活，但同時Cx43蛋白水平和細(xì)胞鉛吸收量下降，提示在Z310細(xì)胞中除Cx43外，還可能存在其他受Src調(diào)控的鉛轉(zhuǎn)運相關(guān)分子。