XIAP調控COMMD1蛋白降解參與鉛暴露擾亂大腦屏障銅轉運的機制研究.pdf

1、鉛是自然界中廣泛存在的一種重金屬污染物。大量研究證實鉛暴露對中樞神經系統(tǒng)具有顯著的毒性作用，鉛暴露可以導致發(fā)育期高級神經功能的損害，如認知障礙、注意力分散和行為異常等；而近年來研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露與包括阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）在內的多種神經退行性疾病的發(fā)生同樣關系密切。鉛神經毒性的機制目前尚未完全揭示，已有的研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露可以影響神經細胞即刻早期基因的表達、干擾神經遞質及其受體的表達和功能、損害神經突觸可塑性、誘導神經膠質細胞異

2、?；罨⑵茐拇竽X屏障的結構和功能、擾亂腦內微量元素代謝等，提示鉛暴露誘導神經毒性的機制可能是涉及影響神經細胞基因表達及腦內微環(huán)境的復雜的過程。
　　銅是人體必需的微量元素，大腦銅含量在體內僅次于肝臟，適宜的銅水平對于大腦的發(fā)育及正常腦功能的維持的十分重要。但是另一方面，游離態(tài)銅離子具有強氧化性，過高的銅離子水平可破壞腦內環(huán)境的氧化-還原平衡，與某些神經退行性疾病可能存在病因學上的密切關聯(lián)。細胞銅代謝是通過各種銅轉運體和伴侶分子的相

3、互作用而實現(xiàn)的，銅離子主要通過copper transporter1（CTR1）進入細胞內，然后通過分子伴侶（如COX17、ATOX1等）轉運到線粒體等細胞器；胞內銅離子的排出主要通過位于高爾基網(wǎng)絡中的ATP7A或ATP7B轉運。有研究發(fā)現(xiàn)銅離子代謝結構域包含體1（Copper Metabolism MURR1 Domain-containing1，COMMD1）可以通過影響ATP7A和ATP7B的表達而參與調控細胞銅離子代謝，而X連鎖

4、凋亡抑制蛋白（XIAP）對于COMMD1蛋白的降解起到重要的調控作用。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)：鉛暴露可以通過影響CTR1、ATP7A等銅轉運蛋白的表達而導致細胞內銅蓄積，提示鉛可能通過擾亂腦內環(huán)境銅代謝而造成氧化應激損傷。但是，XIAP介導的COMMD1降解是否參與鉛暴露影響腦內銅代謝的過程？其分子調控機制是什么？目前尚無相關報道。
　　大腦屏障主要包括血腦屏障（Blood brain barrier,BBB）和血腦脊液屏障（bloo

5、d-cerebrospinal fluid barrier,BCB），二者是維持腦內環(huán)境物質的平衡的重要結構。本研究通過建立體外BBB和BCB細胞模型，研究鉛對大腦屏障細胞銅離子轉運的影響，探討XIAP調控的COMMD1降解在鉛暴露所致大腦屏障銅代謝紊亂中的作用及其機制，為明確鉛暴露擾亂腦內環(huán)境銅離子平衡的關鍵環(huán)節(jié)、闡明其分子調控機制提供研究基礎。
　　目的：本課題以大鼠腦微血管內皮細胞株RBE4和大鼠脈絡叢上皮細胞株Z310為實

6、驗對象，分別建立鉛暴露BBB和BCB體外模型，研究鉛對細胞銅代謝的影響，明確XIAP調控的COMMD1降解是否參與鉛暴露影響ATP7B和ATP7A等銅轉運蛋白水平、誘導胞內銅蓄積的過程，并探討其上下游的分子調控機制。
　　方法：
　　1.RBE4和Z310細胞體外培養(yǎng)，分別建立鉛暴露BBB和BCB模型，采用MTT法篩選合適的鉛暴露劑量。
　　2.原子吸收分光光度法（AAS）檢測細胞內銅水平。
　　3.RT-PCR

7、法檢測鉛暴露后細胞內XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的mRNA表達水平；Western blot法檢測鉛暴露后細胞XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A蛋白表達水平。
　　4.siRNA干涉技術抑制COMMD1表達，觀察ATP7A、ATP7B表達水平及細胞銅吸收量的變化。
　　5.構建質粒高表達XIAP，觀察COMMD1、ATP7A、ATP7B表達水平及細胞銅吸收量的變化。
　　6.分別設計含有野

8、生型和E3泛素連接酶位點突變型XIAP片段的質粒，轉染細胞，觀察COMMD1表達變化，明確其對COMMD1表達調控的功能靶點。
　　結果：
　　1.鉛暴露對RBE4和Z310細胞銅水平的影響RBE4和Z310細胞分別以含有2.5，5，10μmol/L醋酸鉛的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，置于37℃孵箱中以5μmol/L CuCl2孵育2h，AAS檢測結果顯示：與對照組相比，鉛暴露后兩種細胞內銅水平均顯著增高（P＜0.05），并呈劑量-

9、效應關系。
　　2.鉛暴露對RBE4和Z310細胞XIAP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的mRNA和蛋白表達水平的影響Western blot法結果顯示：2.5，5，10μmol/L醋酸鉛暴露24h后，或10μmol/L醋酸鉛暴露24h和48h后，與對照組相比，兩種細胞內XIAP、ATP7B和ATP7A蛋白水平均顯著降低，COMMD1蛋白水平顯著增高（P＜0.01），呈劑量-和時間-效應關系。而與對照組相比，兩種細胞內XI

10、AP、COMMD1、ATP7B和ATP7A的mRNA水平均無顯著改變。
　　3.抑制COMMD1的表達對ATP7B的影響采用siRNA干涉COMMD1表達后，與scramble siRNA對照組相比，COMMD1 siRNA干涉組細胞在鉛處理后ATP7B蛋白水平降低幅度顯著縮?。≒＜0.05），而ATP7A蛋白水平無顯著改變（p＞0.05）。
　　4.干涉COMMD1的表達對RBE4和Z310細胞銅水平的影響使用siRNA干

11、涉COMMD1表達，與scramble siRNA對照組相比，COMMD1 siRNA干涉組細胞在鉛處理后胞內銅水平的升高幅度顯著縮小（P＜0.05）。
　　5.高表達XIAP對COMMD1和ATP7B的影響通過構建質粒高表達XIAP，與空載（Vector）組相比，XIAP高表達組鉛處理后，所引起COMMD1蛋白水平增高、以及對ATP7B水平的下調作用均被顯著抑制（P＜0.05），但對ATP7A的水平無顯著影響（p＞0.05）。<

12、br>　　6.高表達XIAP對RBE4和Z310細胞銅水平的影響通過構建質粒高表達XIAP，與空載（Vector）組相比，XIAP高表達組鉛處理后，胞內銅水平的升高幅度顯著縮小（P＜0.05）。
　　7.XIAP調控COMMD1表達水平的功能結構域的研究分別以含有野生型和E3泛素連接酶位點突變型XIAP的質粒轉染細胞后，與對照組相比，高表達野生型XIAP實驗組COMMD1蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而高表達E3泛素連接酶位點

13、突變型XIAP實驗組COMMD1蛋白水平沒有顯著變化（p＞0.05）。
　　結論：
　　1.鉛暴露可通過下調銅轉運蛋白ATP7A和ATP7B的蛋白水平，而導致血-腦屏障和血-腦脊液屏障細胞內銅水平增高。
　　2.鉛暴露可以引起XIAP蛋白的表達水平降低，使其下游的COMMD1蛋白水平增高，進而特異性地下調ATP7B的蛋白水平，造成細胞銅外排障礙和胞內銅蓄積。
　　3.XIAP-COMMD1-ATP7B的調控發(fā)生于