泛素介導(dǎo)的MTDH蛋白降解機(jī)制及調(diào)控研究.pdf

1、乳腺癌是女性多發(fā)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，其發(fā)病率逐年遞增，目前已躍居女性惡性腫瘤首位，成為女性腫瘤致死第二大原因。雖然近年來(lái)在乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及綜合治療等方面都獲得了很大的進(jìn)步，但是，乳腺癌伴轉(zhuǎn)移患者的5年生存率仍增幅緩慢，目前針對(duì)乳腺癌患者的臨床治療方式還無(wú)法從根本上解決腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移問(wèn)題。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜演變過(guò)程，然而截至目前乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)理仍未闡明，因此，改

2、善乳腺癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量很大程度上依賴(lài)于對(duì)其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)理全面而深入的研究。MTDH蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，尤其在乳腺癌細(xì)胞中MTDH異常積聚。MTDH蛋白與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，然而直至目前，其在腫瘤細(xì)胞中異常積聚的機(jī)理仍未闡明。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MTDH蛋白在乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞中的多聚泛素化水平明顯低于正常人胚腎HEK293細(xì)胞，提示MTDH蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)是轉(zhuǎn)錄和降解兩方

3、面失衡的結(jié)果，MTDH蛋白降解異?？赡苁瞧湓谌橄侔┘?xì)胞中高表達(dá)及易轉(zhuǎn)移的主要原因之一。通過(guò)免疫共沉淀串聯(lián)質(zhì)譜分析篩選得到泛素連接酶FBXW7與MTDH蛋白之間存在相互作用，提示FBXW7可能是MTDH蛋白的特異性泛素連接酶。
　　目的：為了探討泛素連接酶FBXW7與MTDH蛋白之間相互作用機(jī)制，（1）應(yīng)用免疫共沉淀及GST-Pulldown技術(shù)體內(nèi)外鑒定FBXW7與MTDH蛋白之間的相互作用關(guān)系；（2）探討不同亞型FBXW7對(duì)MT

4、DH蛋白穩(wěn)定性影響；（3）探討FBXW7對(duì)MTDH蛋白泛素化水平的調(diào)控作用；（4）檢測(cè)FBXW7對(duì)MTDH蛋白半衰期的調(diào)控作用，希望闡明MTDH蛋白在乳腺癌細(xì)胞異常積聚的機(jī)理；（5）在乳腺癌細(xì)胞中探討FBXW7通過(guò)泛素蛋白酶體途徑調(diào)控MTDH蛋白降解，進(jìn)而對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、移行、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響。本課題有望最終闡明泛素連接酶FBXW7通過(guò)介導(dǎo)MTDH蛋白降解在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，為發(fā)掘乳腺癌治療新靶點(diǎn)奠定理論基

5、礎(chǔ)。
　　方法：（1）首先構(gòu)建MTDH真核表達(dá)載體pcDNA-3.1-MTDH，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，利用免疫共沉淀及液相串聯(lián)質(zhì)譜分析篩選乳腺癌細(xì)胞中MTDH蛋白相互作用蛋白；其次，分別以MTDH蛋白和FBXW7蛋白為誘餌蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，從正反兩方面驗(yàn)證MTDH蛋白與泛素連接酶FBXW7之間的相互作用關(guān)系；最后利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化GST-FBXW7α蛋白，利用GST-Pulldown技術(shù)體外鑒定MTDH蛋白

6、與泛素連接酶FBXW7之間相互作用關(guān)系。（2）首先，構(gòu)建FBXW7不同亞型真核表達(dá)載體pFlag-CMV-FBXW7α、pFlag-CMV-FBXW7β、pFlag-CMV-FBXW7γ和FBXW7干涉載體pSlilencer4.1-shFBXW7，上述載體分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常人胚腎HEK293細(xì)胞，檢測(cè)FBXW7對(duì)MTDH蛋白穩(wěn)定性影響；其次，以MTDH蛋白為誘餌蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在FBXW7過(guò)表達(dá)及

7、干涉表達(dá)條件下MTDH蛋白泛素化水平變化情況；最后，用蛋白合成抑制劑放線(xiàn)菌酮分別處理FBXW7過(guò)表達(dá)和干涉表達(dá)細(xì)胞，檢測(cè)MTDH半衰期，最終闡明FBXW7作為MTDH蛋白泛素連接酶調(diào)控MTDH蛋白降解機(jī)制。（3） FBXW7真核表達(dá)載體pcDNA-3.1-FBXW7α轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和SKBR3，通過(guò)MTT細(xì)胞增殖、細(xì)胞劃痕、Transwell、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)闡明FBXW7通過(guò)介導(dǎo)MTDH蛋白泛素化降解途徑對(duì)乳腺癌

8、細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：（1）首先，通過(guò)免疫共沉淀及液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)分析，篩選出乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中MTDH相互作用蛋白11個(gè)，其中含有一個(gè)泛素連接酶FBXW7；其次，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，分別以MTDH和FBXW7為誘餌蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，從正反兩個(gè)方面證實(shí)了MTDH蛋白和FBXW7蛋白之間存在相互作用；最后利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出GST-FBXW7融合蛋白，并利用GST-Pulldown實(shí)

9、驗(yàn)在體外進(jìn)一步證實(shí)了MTDH蛋白和FBXW7蛋白之間存在相互作用關(guān)系。（2）首先，成功構(gòu)建了FBXW7不同亞型真核表達(dá)載體pFlag-CMV-FBXW7α、pFlag-CMV-FBXW7β和pFlag-CMV-FBXW7γ，轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ均能下調(diào)MTDH蛋白水平，其中以FBXW7α作用最明顯；成功構(gòu)建FBXW7干涉載體pSlilencer4.1-shFBXW7，轉(zhuǎn)染人胚腎

10、HEK293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干涉細(xì)胞內(nèi)源性FBXW7表達(dá)后，MTDH蛋白水平明顯上調(diào)；其次，以MTDH為誘餌蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FBXW7過(guò)表達(dá)組，MTDH蛋白泛素化水平顯著上調(diào)，然而FBXW7干涉組，MTDH蛋白泛素化水平明顯下調(diào)；最后，檢測(cè)FBXW7對(duì)MTDH蛋白半衰期影響，與陰性對(duì)照組相比，F(xiàn)BXW7過(guò)表達(dá)組細(xì)胞MTDH蛋白半衰期明顯縮短，從12小時(shí)縮短至6小時(shí)，然而FBXW7干涉組，MTDH基本不降解。（3）乳腺癌MDA-MB

11、-231和SKBR3細(xì)胞，MTDH蛋白呈高表達(dá)，F(xiàn)BXW7與MTDH蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示FBXW7介導(dǎo)的MTDH蛋白泛素化降解異?？赡苁荕TDH蛋白在乳腺癌細(xì)胞異常聚積的主要原因之一。乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)FBXW7均能抑制細(xì)胞增殖、移行和侵襲能力，并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，然而MTDH蛋白可以在一定程度逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)的FBXW7對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，因此推斷FBXW7通過(guò)介導(dǎo)MTDH蛋白的泛素化降解而抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性表型。
　　結(jié)論：

12、（1）體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)FBXW7與MTDH蛋白存在相互作用關(guān)系。（2）泛素連接酶FBXW7對(duì)MTDH蛋白豐度起到負(fù)調(diào)控作用，其中以FBXW7α作用最明顯。（3）FBXW7在細(xì)胞內(nèi)作為MTDH蛋白的泛素連接酶介導(dǎo)其泛素化；（4）蛋白半衰期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7通過(guò)泛素蛋白酶體途徑調(diào)控MTDH蛋白降解，從而負(fù)向調(diào)控MTDH蛋白半衰期。（5）乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞中，F(xiàn)BXW7與MTDH蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示FBXW7介