Argonaute2蛋白的泛素化調(diào)控.pdf

1、目的：RNA干擾（RNAi）是一種細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中保留的在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行沉默或抑制的調(diào)控方式。RNAi作用廣泛存在于真核細(xì)胞中。在真核細(xì)胞中，RNAi過(guò)程主要由小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）介導(dǎo)完成。siRNA或miRNA識(shí)別并結(jié)合Argonaute2（Ago2）蛋白后形成RNAi的效應(yīng)器—RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。RISC介導(dǎo)siRNA或miRNA對(duì)于靶mRNA的識(shí)別及切割，在RNAi過(guò)程中發(fā)揮

2、了至關(guān)重要的作用。因此RISC的核心組分Ago2蛋白被稱為RNAi裝置的催化引擎。因此對(duì)于核心分子Ago2的調(diào)控研究有助于深入了解RNAi的作用過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了Ago2的相互作用蛋白26S蛋白酶體ATP酶亞基3（PSMC3）和 RBBP6。并證實(shí)了 PSMC3可以通過(guò)泛素化-蛋白酶體途徑依賴的方式調(diào)節(jié)Ago2蛋白的穩(wěn)定性，然而具體的分子機(jī)制尚不明確。本課題擬從泛素化角度展開PSMC3和RBBP6蛋白對(duì)

3、Ago2蛋白的穩(wěn)定性調(diào)控機(jī)制的研究。
　　方法：首先，利用溶酶體及蛋白酶體抑制劑處理細(xì)胞，檢測(cè)Ago2蛋白水平及泛素化水平的變化。然后，通過(guò)檢索 BioGRID數(shù)據(jù)庫(kù)選定 PSMC3可能的相互作用分子USP14為候選研究對(duì)象。其后，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、免疫熒光結(jié)合共聚焦顯微鏡采集圖像分析、放線菌酮實(shí)驗(yàn)、Western blot及免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PSMC3為USP14的相互作用蛋白并且Ago2是USP14的作用底物且USP14可

4、以調(diào)控Ago2的泛素化水平。隨后，通過(guò)構(gòu)建USP14的不同突變體并結(jié)合免疫共沉淀分析確定了USP14與Ago2及PSMC3相互作用的結(jié)構(gòu)域；通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)確定了PSMC3對(duì)于Ago2的穩(wěn)定作用依賴于USP14。同時(shí)，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了RBBP6與Ago2蛋白的相互作用，并通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)確定了RBBP6可以促進(jìn)Ago2蛋白的泛素化并增強(qiáng)Ago2的降解。最后，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)確定

5、了RBBP6，PSMC3及USP14對(duì)于RNAi作用的影響。
　　結(jié)果：蛋白酶體抑制劑可以促進(jìn)泛素化的Ago2蛋白在體內(nèi)的累積。USP14可以分別與PSMC3及Ago2相互作用。干擾USP14可以明顯縮短Ago2蛋白的半衰期。USP14特異性抑制劑能夠促進(jìn)泛素化的 Ago2在細(xì)胞內(nèi)累積。 USP14可以調(diào)控Ago2蛋白的水平且MG132使得此調(diào)控作用消失。確定了USP14分別與PSMC3及Ago2相互作用的最小結(jié)構(gòu)域。RBBP6與