維甲酸受體α(RARα)泛素化降解的調(diào)控機制研究.pdf

1、背景:
　　誘導(dǎo)分化是指惡性腫瘤細(xì)胞在分化誘導(dǎo)劑的作用下，向正?；蚪咏５募?xì)胞方向分化逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，它強調(diào)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞惡性表型，使其趨于成熟分化，一般不引起腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而克服了傳統(tǒng)化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時對正常組織細(xì)胞的損傷所帶來的毒副作用。腫瘤的分化療法作為一種區(qū)別于傳統(tǒng)腫瘤治療理念的治療手段已越來越多地得到了人們的關(guān)注。目前，常用的分化誘導(dǎo)劑包括維甲酸（retinoic acid，RA）類化合物、極性化合物、細(xì)胞因子、維

2、生素D3及其類似物、某些抗腫瘤藥物及中草藥等，其中RA類化合物是分化誘導(dǎo)劑中最為重要、療效最為確切并應(yīng)用于臨床的一類藥物。隨著全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）分化治療急性早幼粒細(xì)胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia, APL）的成功，RA類藥物也被越來越多地用于預(yù)防及治療包括乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的惡性腫瘤，而RA類藥物的廣泛應(yīng)用也促使研究人員

3、對其分化誘導(dǎo)機制進行了深入研究，以期尋找與細(xì)胞分化有關(guān)的潛在藥物作用靶點，并基于開發(fā)全新的高效分化誘導(dǎo)劑及發(fā)現(xiàn)有效的藥物聯(lián)用方案而指導(dǎo)分化療法在臨床的合理應(yīng)用。
　　已有研究表明，RA通過與維甲酸受體結(jié)合而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用，維甲酸受體包括RARs（retinoic acid receptors）和RXRs（retinoid X receptors）二類，分別有α，β，γ三種亞型。維甲酸受體作為配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子形成RAR/R

4、XR異二聚體，與維甲酸反應(yīng)元件（RA response elements，RAREs）結(jié)合而啟動下游分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。然而隨著研究的深入，有研究人員發(fā)現(xiàn)RA在誘導(dǎo)細(xì)胞分化的過程中能夠促使維甲酸受體α（RARα）發(fā)生泛素蛋白酶體依賴的降解，本實驗室的前期研究也已表明，RARα的這種泛素化降解并不利于ATRA分化誘導(dǎo)作用的充分發(fā)揮，而采用蛋白酶體抑制劑如MG132及PS341等能有效逆轉(zhuǎn)ATRA引起的RARα下調(diào)，并協(xié)同ATRA促進細(xì)胞分

5、化。因此探討RARα泛素化降解的調(diào)控機制有望為尋找基于RA的分化療法療效的增強提供全新的突破方向。
　　本研究將以ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程中的相關(guān)分子現(xiàn)象為出發(fā)點，圍繞蛋白質(zhì)的翻譯后修飾及蛋白-蛋白相互作用等兩個層面，從三個方向?qū)ふ壹疤接慠ARα泛素化降解過程的調(diào)控因子:
　　一、RARα的sumo-1修飾對其泛素化降解的影響。已有文獻表明，RARα可以被sumo-1修飾，而sumo-1已被證實能夠通過多種分子機制以不同方式

6、調(diào)控蛋白質(zhì)的泛素化降解過程，因此sumo-1是否及如何參與調(diào)節(jié)RARα的泛素化降解是本課題所要深入研究的內(nèi)容之一;
　　二、E2F1調(diào)控RARα泛素化降解的作用研究。細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F1通過其轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控下游蛋白的表達，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)諸多分子事件。而我們的初步研究表明，E2F1能夠調(diào)控RARα的蛋白水平，卻并不影響其mRNA水平，因此在這一部分中我們將深入研究E2F1是否具有調(diào)控RARαt泛素化降解過程的作用;
　　

7、三、MDM2介導(dǎo)RARα泛素化降解的機制研究。蛋白的泛素化降解過程是一個由多種酶參與調(diào)控的有序過程，而泛素E3連接酶是整個過程中至關(guān)重要的因子，其直接決定了降解過程的靶向性及準(zhǔn)確性，在蛋白質(zhì)的泛素化降解過程中處于中心環(huán)節(jié)。我們的初步研究表明，具有泛素E3連接酶活性的蛋白MDM2可能具有促進RARα泛素化降解的功能，因此本部分的研究我們將基于前期的初步研究結(jié)果，探討MDM2是否可能為RARα的泛素E3連接酶。
　　第一部分RARα的

8、sumo-1修飾對其泛素化降解的影響
　　目的:RARα在其配體RA作用下通過與其他信號分子的相互作用調(diào)控與細(xì)胞生長、分化、存活及死亡等相關(guān)的諸多分子事件，被認(rèn)為是最重要的維甲酸受體之一。已有研究表明，RARα在RA作用過程中發(fā)生泛素化降解，然而對于RA通過何種分子機制促進RARα的泛素化降解卻鮮有報道。小泛素樣蛋白sumo-1于近年來被證實能夠共價修飾在細(xì)胞生命活動中起重要作用的多種蛋白質(zhì)，并在調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要而復(fù)雜

9、的作用。本文將以ATRA作為工具藥，系統(tǒng)研究RARα的sumo-1修飾在其泛素化降解及細(xì)胞分化過程中的作用。
　　方法與結(jié)果:在已有文獻報道RARα能夠被sumo-1修飾的基礎(chǔ)上，我們通過對RARα蛋白編碼區(qū)氨基酸序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，第399位賴氨酸完全符合已被證實能夠與sumo蛋白結(jié)合的賴氨酸的特點，因此第399位賴氨酸可能為RARα上sumo-1的結(jié)合位點。基于此，我們通過點突變技術(shù)將編碼第399位賴氨酸的密碼子進行了突變，使

10、其轉(zhuǎn)而編碼精氨酸，得到RARα-K399R的突變質(zhì)粒，并進一步采用免疫沉淀及Western blotting的方法在COS7細(xì)胞中證實第399位賴氨酸的突變顯著減弱了RARα的sumo-1修飾水平，因此我們認(rèn)為，第399位賴氨酸確實為RARα的sumo-1修飾位點。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)ATRA在促進RARα泛素化降解的過程中伴隨著sumo-1蛋白及與sumo-1結(jié)合的RARα蛋白的下調(diào)，提示sumo-1可能參與RARα泛素化降解過程的調(diào)控

11、。進而我們對比了野生型RARα(RARα-WT)及第399位賴氨酸突變的RARα（RARα-K399R）在蛋白穩(wěn)定性及泛素化降解過程中的差異。Western blotting結(jié)果顯示，采用CHX抑制蛋白的合成后，RARα-K399R的降解速度顯著高于RARα-WT，而第399位賴氨酸突變后，ATRA也同樣能增強RARα的泛素化水平并加速其降解。熒光素酶雙報告基因檢測系統(tǒng)及Real Time RT-PCR實驗則進一步證實在ATRA作用下R

12、ARα-K399R的轉(zhuǎn)錄活性顯著低于RARα-WT。同時，我們采用siRNA干擾技術(shù)對細(xì)胞內(nèi)的sumo-1進行了敲除，結(jié)果表明，sumo-1的低表達顯著降低了RARα的穩(wěn)定性及ATRA誘導(dǎo)的RARα轉(zhuǎn)錄激活水平。在此基礎(chǔ)上，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對已轉(zhuǎn)染RARα-WT或RARα-K399R的HL60R細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后細(xì)胞表面抗原CD11b的表達進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同于RARα-WT，RARα-K399R并不能促使HL60R細(xì)胞發(fā)生分

13、化。而Western b1otting結(jié)果也證實，敲除U2OS細(xì)胞中的sumo-1后，ATRA誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞分化被顯著抑制。
　　結(jié)論:RARα的sumo-1修飾拮抗其泛素化降解，并促進了RARα的轉(zhuǎn)錄激活及ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化，對于ARα泛素化降解調(diào)控機制的研究是一個有益的補充。
　　第二部分E2F1調(diào)控RAR泛素化降解的作用研究
　　目的:E2F1是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過其轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)錄激活下游一系列與細(xì)胞

14、生長、凋亡及分化相關(guān)的蛋白的表達，在細(xì)胞生命活動中起著中心調(diào)節(jié)作用。隨著研究的深入，其不依賴于下游蛋白的轉(zhuǎn)錄激活而對靶蛋白的調(diào)控作用也越來越得到研究者的關(guān)注。我們的初步研究證實，E2F1可能參與調(diào)控RARα的泛素化降解過程。在本部分研究中，我們將在前期研究的基礎(chǔ)上在骨肉瘤U2OS細(xì)胞中深入探討E2F1調(diào)控RARα泛素化降解的作用，以期發(fā)現(xiàn)RARα泛素化降解過程的全新調(diào)控因子及不依賴于E2F1轉(zhuǎn)錄激活而受其調(diào)控的靶蛋白。
　　方法與

15、結(jié)果:首先，我們采用免疫組化技術(shù)對多例骨肉瘤臨床樣本中的RARα及E2F1蛋白表達情況進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RARα在約71.4％的骨肉瘤中呈陰性表達，而E2F1在約86.5％的骨肉瘤中呈陽性表達，且兩者表達水平呈一定的負(fù)相關(guān)，SPSS軟件計算其相關(guān)系數(shù)為-0.402。這一結(jié)果提示，E2F1與RARα間可能存在一定的調(diào)控作用。為深入研究這一作用，我們在U2OS細(xì)胞中分別采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或siRNA干擾技術(shù)增加或減少了細(xì)胞內(nèi)E2F1的表達。W

16、estern blotting及RealTime RT-PCR結(jié)果顯示，E2F1高表達促進RARα的下調(diào)，而E2F1低表達則上調(diào)RARα，且這一作用并不依賴于RARα mRNA水平的改變。進一步地，我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132顯著逆轉(zhuǎn)E2F1高表達引起的RARα下調(diào)，而高表達E2F1則明顯降低RARα蛋白的穩(wěn)定性，縮短其半衰期。同時我們采用免疫沉淀技術(shù)證實下調(diào)細(xì)胞內(nèi)E2F1蛋白表達抑制了ATRA引起的RARα蛋白的多聚泛素化。以上結(jié)

17、果均表明，E2F1能夠通過影響RARα的泛素化降解過程調(diào)控細(xì)胞內(nèi)RARα蛋白水平。而熒光素酶雙報告基因檢測系統(tǒng)及Real Time RT-PCR實驗則證實E2F1在調(diào)控RARα穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上負(fù)性調(diào)控了ATRA誘導(dǎo)的RARα轉(zhuǎn)錄激活。另一方面，通過免疫熒光技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)U2OS細(xì)胞中內(nèi)源性的E2F1與RARα存在一定的共定位，而免疫沉淀及GST-pull down技術(shù)則進一步證實E2F1與RARα在體內(nèi)外均能發(fā)生相互結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)

18、建了多個不同功能區(qū)域缺失的E2F1質(zhì)粒突變體，并將其分別與RARα共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中，免疫沉淀結(jié)果顯示E2F1蛋白上的第191-379位氨基酸所在結(jié)構(gòu)域可能為RARα在其上的結(jié)合區(qū)域。Westernblotting結(jié)果則表明當(dāng)缺失191-379位氨基酸后，E2F1促進RARα下調(diào)的作用消失，即E2F1促進RARα降解依賴于兩者的直接結(jié)合。基于E2F1對RARα泛素化降解過程的調(diào)節(jié)作用，我們對E2F1在ATRA誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞分化過

19、程中的作用進行了研究。結(jié)果表明，E2F1依賴于與RARα蛋白的結(jié)合負(fù)調(diào)控ATRA誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞分化。而進一步地，我們發(fā)現(xiàn)E2F1在原代骨肉瘤細(xì)胞中的表達水平也在一定程度上決定了原代骨肉瘤細(xì)胞對ATRA的敏感性。
　　結(jié)論:E2F1通過與RARα蛋白的結(jié)合調(diào)節(jié)RARα的泛素化降解過程，并進一步負(fù)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性及ATRA誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞分化。
　　第三部分MDM2介導(dǎo)RARα泛素化降解的機制研究
　　目的:在前兩部分的

20、研究中，我們發(fā)現(xiàn)了兩個RARα泛素化降解過程的可能調(diào)控因子，而蛋白質(zhì)依賴于泛素蛋白酶體通路的降解是一個由多種酶介導(dǎo)的復(fù)雜而有序的分子過程。其中泛素E3連接酶在整個過程中起著中心調(diào)節(jié)作用，其通過特異性地識別靶蛋白決定著整個過程的精確性。因此尋找RARα泛素化過程的泛素E3連接酶對于更好地理解RARα泛素化降解過程的調(diào)控具有積極的推動作用。在前期能與RARα結(jié)合的蛋白的篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)了MDM2這一細(xì)胞內(nèi)重要的泛素E3連接酶，因此本部分

21、的研究我們將在確定MDM2能夠促進RARα泛素化降解的基礎(chǔ)上致力于探討MDM2是否可能為RARα的泛素E3連接酶。
　　方法與結(jié)果:我們在U2OS細(xì)胞中采用ATRA作用后，細(xì)胞內(nèi)RARα蛋白發(fā)生時間依賴性下調(diào)。同時我們發(fā)現(xiàn)出核抑制劑LMB能夠顯著逆轉(zhuǎn)ATRA引起的RARα蛋白下調(diào)，即ATRA誘導(dǎo)的RARα泛素化降解發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中。Westernblotting及免疫熒光實驗則證實，ATRA短時間處理U2OS細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)MDM2蛋

22、白發(fā)生上調(diào)，并在細(xì)胞質(zhì)中累積，這一結(jié)果提示MDM2可能與ATRA觸發(fā)的RARα泛素化降解有關(guān)。為了深入研究這一作用，我們在U2OS細(xì)胞中過表達了MDM2蛋白，Western blotting結(jié)果顯示，MDM2依賴于其泛素連接酶活性促進RARα蛋白下調(diào)，而這一作用在ATRA處理后更甚。同時我們構(gòu)建了MDM2穩(wěn)定低表達的U2OS細(xì)胞株，并對其中RARα蛋白水平進行了檢測。結(jié)果表明，MDM2低表達上調(diào)了RARα蛋白水平，并增強了其蛋白穩(wěn)定性。

23、進一步研究顯示，MDM2高表達促進了ATRA引起的RARα多聚泛素化水平，而低表達則反之。同時體外泛素化實驗證實，MDM2的泛素連接酶活性在RARα的多聚泛素化過程中是不可或缺的。另一方面，我們采用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)、外源性的MDM2及RARα均存在一定的共定位，免疫沉淀結(jié)果則進一步證實MDM2能與RARα發(fā)生相互結(jié)合，并且ATRA能夠促進兩者的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，采用免疫沉淀技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白上第1-109位氨基酸所在的結(jié)構(gòu)域為R

24、ARα蛋白的結(jié)合位點，而同樣能夠結(jié)合于MDM2蛋白該結(jié)構(gòu)域的小分子化合物Nutlin-3則能顯著干擾MDM2-RARα的結(jié)合。同時，Western blotting結(jié)果證實，缺失RARα結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MDM2蛋白不能促進RARα的下調(diào)，而Nutlin-3則能夠顯著逆轉(zhuǎn)ATRA引起的RARα蛋白下調(diào)，提示MDM2促進RARα泛素化降解的作用依賴于與RARα蛋白的相互結(jié)合。基于MDM2對RARα蛋白的負(fù)性調(diào)控，我們對MDM2在ATRA誘導(dǎo)的U

25、2OS細(xì)胞分化過程中的作用進行了研究。結(jié)果表明，高表達MDM2抑制了ATRA引起的U2OS細(xì)胞生長抑制、OPN、RUNX2、ALP等分化標(biāo)記蛋白的上調(diào)及細(xì)胞內(nèi)ALP活性的增加，即過表達MDM2抑制ATRA誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞分化，而低表達MDM2則相反。同時，MDM2泛素連接酶活性抑制劑HLI373被發(fā)現(xiàn)能夠顯著上調(diào)RARα蛋白，降低其由ATRA引起的多聚泛素化水平，并協(xié)同ATRA增強U2OS及原代骨肉瘤細(xì)胞的分化水平。
　　結(jié)論: