維甲酸相關(guān)的JWA基因?qū)θ斯撬杌|(zhì)細(xì)胞功能調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：造血微環(huán)境(hematopoietic microenvitoninent，HME)是支持和調(diào)節(jié)造血細(xì)胞定居、增殖、分化、發(fā)育和成熟的內(nèi)環(huán)境。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是造血微環(huán)境的重要組成部分，其損傷可導(dǎo)致造血微環(huán)境損害，影響移植后骨髓造血重建的過(guò)程。促進(jìn)BMSCs功能恢復(fù)，是修復(fù)}tME的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸(retinoic acid，RA)，尤其是全反式維甲酸(al

2、l-trans retinoic acid，atRA)可以通過(guò)影響靶基因的表達(dá)調(diào)控BMSCs粘附、遷移功能，提示RA相關(guān)基因在BMSCs功能調(diào)控中可能起重要作用。JWA基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種受維甲酸誘導(dǎo)表達(dá)增高的細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)基因，可能參與細(xì)胞分化調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸代謝等眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究顯示，atRA介導(dǎo)的細(xì)胞分化和生長(zhǎng)調(diào)控作用至少部分是通過(guò)JWA基因的表達(dá)調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，JWA基因可能在BMSCs功能調(diào)控以及造血微環(huán)境重

3、建中起作用。 本研究觀察了atRA作用下，人BMSCs粘附、遷移等功能變化與JWA基因表達(dá)之間的關(guān)系，并利用核酶技術(shù)，檢測(cè)JWA基因表達(dá)抑制后人BMSCs粘附、遷移功能的變化。以探討維甲酸相關(guān)的JWA基因在人BMSCs粘附、遷移功能調(diào)控中的作用。 方法： 1．分離培養(yǎng)臨床27例造血干細(xì)胞移植(PBSCT)患者預(yù)處理前后BMSCs，檢測(cè)細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù))、BMSCs培養(yǎng)上清液中可溶

4、性ICAM-1(sicAM-1)水平(放免法)、BMSCs對(duì)CD34<'+>細(xì)胞的粘附率，以及不同濃度atRA(0.0lμmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)對(duì)上述指標(biāo)的影響。 2．分離培養(yǎng)臨床骨髓像正常的非惡性血液病患者BMScs，不同濃度atRA(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)干預(yù)24h后，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)JWA mRNA表達(dá)(sqRT-PCR法)、I

5、CAM-1和VCAM-1表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù))、FN和LN表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)法)、細(xì)胞遷移(改良Boyden小室法)、F-actin表達(dá)(激光共聚焦顯微鏡)，并檢測(cè)共培養(yǎng)條件下BMSCs細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞的粘附率以及Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期(流式細(xì)胞術(shù))、FAK mRNA表達(dá)(sqRT-PCR)、FAK蛋白表達(dá)(Western blot法)、VLA-4和LFA-1表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù))。JWA mRNA表達(dá)與粘附、遷移指

6、標(biāo)之間進(jìn)行相關(guān)性分析。 3．構(gòu)建JWA基因特異性錘頭型核酶逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染入BMSCs，篩選鑒定后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)JWAmRNA表達(dá)(sqRT-PCR)。 4．檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù))、FN和LN表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)法)、細(xì)胞遷移(改良Boyden小室法)、F-actin和α-tubulin表達(dá)(激光共聚焦顯微鏡)，并檢測(cè)共培養(yǎng)條件下BMSCs細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞的粘附率以及Jur

7、kat細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期(流式細(xì)胞術(shù))變化。 結(jié)果： 1．PBSCT預(yù)處理后，BMSCs表面ICAM-1、VCAM-1以及培養(yǎng)上清液中sICAM-1水平降低，BMSCs對(duì)CD34<'+>細(xì)胞粘附率降低。atRA作用后，BMSCs表面ICAM-1表達(dá)增加，培養(yǎng)上清液中sICAM-1水平升高，BMSCs對(duì)CD34<'+>細(xì)胞的粘附率增加。 2．a(chǎn)tRA作用后，BMSCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器易見(jiàn)，可見(jiàn)明

8、顯細(xì)胞微絲骨架；JWA-mRNA表達(dá)以及ICAM-1、VCAM-1、FN、LN、F-actin表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)均隨atRA濃度增高而增加；BMSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞的粘附率顯著增高，Jurkat細(xì)胞FAKmRNA、FAK蛋白及VLA-4、LFA-1表達(dá)上調(diào)、增殖增強(qiáng)。相關(guān)性分析顯示，細(xì)胞內(nèi)JWA mRNA表達(dá)量與atRA濃度及ICAM-1、VCAM-1、LN表達(dá)量、細(xì)胞粘附率、遷移細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)。 3．JWA核酶逆轉(zhuǎn)錄病毒

9、重組載體轉(zhuǎn)染入BMSCs后(B-JWARZ組)，JWA mRNA表達(dá)量顯著低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(BMSCs組)和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(B-pLXSN組)。 4．與B-pLXSN組及BMSCs組比較，B-JWARZ組細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、FN、LN表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低，F(xiàn)-actin及α-tubulin表達(dá)降低，對(duì)Jurkat細(xì)胞的粘附率降低，共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞增殖減慢。 結(jié)論： 1． atRA可能通過(guò)上調(diào)

10、BMSCs粘附分子表達(dá)，部分修復(fù)外周血造血干細(xì)胞移植患者受損BMSCs的粘附功能。 2． atRA可能通過(guò)上調(diào)JWA基因的表達(dá)調(diào)控BMSCs功能。 3． JWA基因及其表達(dá)產(chǎn)物可能參與BMSCs粘附分子表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)維持及細(xì)胞遷移功能的調(diào)控。 本研究為探討B(tài)MSCs功能的基因調(diào)控機(jī)制提供了一個(gè)新的思路，對(duì)造血細(xì)胞回髓定位、分化增殖調(diào)控機(jī)制的研究也有幫助，并對(duì)進(jìn)一步闡明JWA基因的功能提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。增強(qiáng)BMS