siRNA阻斷兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PPARγ基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的： 酒精性股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)發(fā)病率高。目前，酒精性O(shè)NFH早期病例采取保守治療，晚期病例行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。但是，保守的療法效果差，手術(shù)療法有很多并發(fā)癥。近年來(lái)的研究顯示：在體外實(shí)驗(yàn)中酒精可以通過增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)內(nèi)過氧化物酶體增殖子活化受體γ(peroxisome proliferator-act

2、ivated receptor-γ，PPAR γ)基因的表達(dá)而誘導(dǎo)MSCs分化為脂肪細(xì)胞，使成骨分化減少，這與體內(nèi)酒精中毒導(dǎo)致的股骨頭內(nèi)脂肪細(xì)胞增加、骨質(zhì)疏松的病理改變一致。PPAR γ是一種成脂轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞成熟為脂肪細(xì)胞，它在前脂肪細(xì)胞中不表達(dá)，而在脂肪分化過程中表達(dá)，并先于大多數(shù)脂肪基因的表達(dá)。沒有PPARγ時(shí)，前脂肪細(xì)胞難以分化為脂肪細(xì)胞。在成脂作用和脂肪細(xì)胞分化中，PPARγ起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。若MSCs內(nèi)PP

3、ARγ表達(dá)，則其分化為脂肪細(xì)胞，抑制PPARγ活性可以抑制MSCs的脂肪分化，保持MSCs分化為成骨細(xì)胞。對(duì)酒精性O(shè)NFH的發(fā)病機(jī)制從基因水平給出了解釋。目前RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)逐漸成熟，利用此技術(shù)有可能干擾或阻斷酒精誘導(dǎo)MSCs內(nèi)PPARγ基因的表達(dá)，從而抑制酒精誘導(dǎo)MSCs分化為脂肪細(xì)胞，保持其成骨分化，促進(jìn)骨修復(fù)和重建，達(dá)到針對(duì)發(fā)病起始環(huán)節(jié)防治酒精性O(shè)NFH的目的。故本實(shí)驗(yàn)旨在觀察采用RNA

4、i技術(shù)阻斷酒精誘導(dǎo)MSCs內(nèi)PPAR γ基因的表達(dá)的效果，為在發(fā)病起始環(huán)節(jié)防治酒精性O(shè)NFH提供可靠的科學(xué)依據(jù)。 第一部分：針對(duì)PPAR γ siRNA載體的構(gòu)建和病毒包裝 方法： 利用Takara、Ambion和promega siRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，掃描兔PPARγ基因(AF013266)，依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則，BLAST分析與其他基因家族的同源性。最后確定3個(gè)編碼序列是19個(gè)堿基的siRNA靶

5、序列，同時(shí)隨機(jī)組合出一條無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA序列。分別合成4對(duì)編碼短發(fā)卡RNA序列的DNA單鏈，兩端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。將合成的4對(duì)發(fā)卡DNA分別退火，然后克隆入T載體pGEM-T；經(jīng)過T7/SP6為引物的PCR擴(kuò)增篩選，得到pGEM-T-siPPARγ-1、pGEM-T-siPPAR γ-2、pGEM-T-siPPAR γ-3和pGEM-T-C。BamHI 和 XhoⅠ雙酶切pGEM-T-siPPAR γ-1、pGE

6、M-T-siPPAR γ-2、pGEM-T-siPPAR γ-3、pGEM-T-C和siRNA載體pRNAT-U6.2/Lenti，分別回收雙粘發(fā)卡DNA片段和線形化雙粘siRNA載體；將4個(gè)雙粘發(fā)卡DNA片段分別亞克隆入siRNA載體，通過BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切和PCR篩選、鑒定和DNA序列分析，得到質(zhì)粒型siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-1，pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-

7、2，pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-3，和pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C。采用脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM> 2000包裹構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體和輔助包裝載體，共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，產(chǎn)生含有表達(dá)siRNA的Lentivirus病毒顆粒：最后對(duì)其進(jìn)行純化和病毒滴度測(cè)定。 結(jié)果： 1．PPAR γ siRNA靶區(qū)段篩選：篩選得到針對(duì)兔PPAR γ基因的3個(gè)siRNA靶

8、序列，分別是GGCCTCCTTGATGAATAAA(677-695)，GCAGGAGCAGAGCAAAGAA(497-515)和GGAAAGACGACAGACAAAT(402-420)。 2．發(fā)卡DNA片段的克?。篜PAR γ和對(duì)照發(fā)卡樣siRNA單鏈DNA退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后，轉(zhuǎn)化JM109，藍(lán)白篩選后隨機(jī)各選擇10菌落以T7/SP6作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，都得到有為252bp擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆。 3

9、．亞克隆入siRNA表達(dá)載體：連接pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-1、2、3和pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C轉(zhuǎn)化JM109，在Amp<'+>LB平板上培養(yǎng)，都長(zhǎng)出10個(gè)以上陽(yáng)性菌落；利用pRNAT-U6.2/Lenti插入鑒定引物擴(kuò)增鑒定，4種亞克隆重組子都有擴(kuò)增片段為560bp的陽(yáng)性克?。环謩e提取重組質(zhì)粒，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，證實(shí)得到pRNAT-U6.2/Lent

10、i-siPPAR-1、2、3和pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C。對(duì)插入序列DNA測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)比較，完全一致。 4．表達(dá)siRNA的Lentivirus病毒包裝：亞克隆重組子與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，得到滴度為2.1×10<'7>IU/ml-4.3×10<'7> IU/ml的表達(dá)siRNA的Lentivirus病毒顆粒。 第二部分：siRNA阻斷酒精誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PPAR γ表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研

11、究 方法： 選用新西蘭白兔取骨髓，制備兔MSCs。實(shí)驗(yàn)共分7組，對(duì)照組(Normal，N)：?jiǎn)渭兊腗SCs；模型組(Model，M)：?jiǎn)渭兙凭T導(dǎo)；感染空載體組(Control 0，C0)：酒精誘導(dǎo)同時(shí)感染空載體pRNAT-U6.2/Lenti包裝產(chǎn)生的Lentivirus病毒；感染無(wú)關(guān)siRNA組(Control 1，C1)：酒精誘導(dǎo)同時(shí)感染pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C包裝產(chǎn)生的Lontivi

12、rus病毒；干擾1、2、3組(siRNA1，S1、siRNA 2，S2、siRNA 3，S3．)：酒精誘導(dǎo)同時(shí)感染pRNAT-U6.2/Lenti-siPPARγ-1、2、3包裝產(chǎn)生的Lentivirus病毒。第二代MSCs接種子6孔培養(yǎng)板(或培養(yǎng)瓶)中，每孔加入包裝病毒，病毒量相當(dāng)于每個(gè)MSCs感染10個(gè)包裝病毒，感染12h，然后換完全高糖DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)在需要酒精誘導(dǎo)的各組中加入酒精，酒精終濃度為0.09mel/L，進(jìn)行誘導(dǎo)。在

13、以后的培養(yǎng)中，換液時(shí)對(duì)需要酒精誘導(dǎo)的各組都加入酒精，酒精終濃度為0.09 mol/L。逐日用倒置顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。在酒精誘導(dǎo)3、5、7、14天時(shí)，均用熒光定量RT-PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)各組MSCs內(nèi)PPAR γ mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量。在酒精誘導(dǎo)14天時(shí)，對(duì)培養(yǎng)MSCs用蘇丹Ⅲ染色，進(jìn)行脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)；用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)MSCs骨鈣素分泌量、細(xì)胞的ALP活性和細(xì)胞的TG含量。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)

14、±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 結(jié)果 1．包裝病毒感染觀察：熒光顯微鏡觀察可見，感染空載體組、感染無(wú)關(guān)siRNA組、干擾1組、干擾2組和干擾3組的MSCs細(xì)胞，幾乎100％都可發(fā)出綠色熒光，而對(duì)照組和模型組未見任何熒光，顯示包裝病毒感染MSCs效率很高。 2．熒光定量RT-PCR：模型組、感染空載體組、感染無(wú)關(guān)siRNA組在酒精

15、誘導(dǎo)3天后PPAR γ mRNA表達(dá)量就迅速升高，持續(xù)酒精誘導(dǎo)下，一直保持高水平表達(dá)；對(duì)照組在14天的培養(yǎng)中，細(xì)胞內(nèi)PPAR γ mRNA表達(dá)水平相對(duì)恒定，保持一個(gè)較低的水平；3個(gè)干預(yù)組都能夠不同程度的抑制細(xì)胞PPAR γ mRNA的表達(dá)，其抑制效果干擾1組>干擾3組>干擾2組，抑制效果隨時(shí)間的延續(xù)而逐漸減弱。 3．Western_b10t：酒精誘導(dǎo)3、5、7、14天，免疫印跡顯示，對(duì)照組PPAR γ蛋白印跡較淺，而模型組、感染

16、空載體組和感染無(wú)關(guān)siRNA組PPAR γ蛋白印跡較對(duì)照組深；干擾1組、干擾2組和干擾3組PPARγ蛋白印跡較對(duì)照組淺，表明包裝siRNA病毒能夠有效地抑制MSCs內(nèi)PPAR γ蛋白的表達(dá)水平。 4．脂肪細(xì)胞數(shù)和TG含量：酒精誘導(dǎo)14天，與對(duì)照組比較，模型組、感染空載體組、感染無(wú)關(guān)siRNA組中脂肪細(xì)胞數(shù)多、細(xì)胞TG含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，干擾1組、干擾2組和干擾3組的脂肪細(xì)胞數(shù)接近、細(xì)胞內(nèi)TG

17、含量稍高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5．骨鈣素分泌和ALP活性：酒精誘導(dǎo)14天，與對(duì)照組比較，模型組、感染空載體組和感染無(wú)關(guān)siRNA組中細(xì)胞分泌骨鈣素減少、細(xì)胞ALP活性減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，干擾1組、干擾2組和干擾3組中細(xì)胞分泌骨鈣素量接近、細(xì)胞ALP活性稍低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建3個(gè)靶向兔PPAR γ基因的真核siRNA載體，通過