Nell-1基因轉染犬骨髓基質干細胞的成骨實驗研究.pdf

1、各種原因造成的大段骨缺損的修復是臨床極為棘手的問題。組織工程（tissue engineering）技術，特別是基因強化組織工程(gene-enhanced tissueengineering)技術的出現(xiàn)給人們提供了可能最終解決問題的理想途徑。骨髓基質干細胞（Bone marrow stromal cell, BMSc）目前被認為是骨組織工程最有價值的種子細胞，是目前基因強化組織工程骨常用的靶細胞。Nell-1（Nel-like,typ

2、e1molecule,Nel 樣I 型分子）作為一種新克隆的成骨基因，具有明顯的成骨作用，其產(chǎn)物蛋白可作為骨組織工程中一種新的生長因子，并且Nell-1 蛋白只作用于顱頜面的成骨細胞，具有生物學特異性。目前，將Nell-1基因轉染BMSc 應用于頜骨組織工程研究，國內(nèi)外尚無相關報導。在本研究中我們構建了含重組人Nell-1 基因的逆轉錄病毒載體并轉染犬BMSc，并對其復合纖維蛋白膠（Fibers Glue, FG）生物材料后修復犬下頜骨

3、2.0cm x1.5cmx0.5cm 骨缺損的能力進行評價，從而探討建立利用經(jīng)Nell-1 基因轉染的BMSc 構建組織工程化骨組織的方法。 我們通過（1）構建Nell-1 逆轉錄病毒載體（PLNCX2- Nell-1），制備含Nell-1 目的基因的重組逆轉錄病毒液，感染犬骨髓基質干細胞，使用原位雜交、RT-PCR以及免疫組織化學的方法檢測Nell-1 在BMSc中的表達。（2）采用Rhodamine phalloidin-

4、DAPI熒光染色，定量分析了Nell-1 轉染對BMSc細胞伸展性的影響，采用Jet impingement系統(tǒng)檢測Nell-1 轉染對BMSc細胞粘附性的影響，采用MTT法對比分析經(jīng)轉染與未經(jīng)轉染BMSc的增殖情況，NPP法檢測細胞堿性磷酸酶（ALP）合成情況，3H脯氨酸摻入方法檢測膠原合成情況，放射免疫方法測定細胞骨鈣素（BGP）、層粘連蛋白（LN）合成情況。（3）制備Beagle犬下頜骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm缺損實

5、驗模型，單純病毒液修復實驗分為4 組：PLNCX2-Nell-1+ FG修復組； PLNCX2+ FG修復組；單純FG生物材料修復組；空白組，未加任何填充材料，于術后采用大體觀察、X線觀察、組織學觀察方法對骨缺損修復情況進行對比檢測。（4）將制備的病毒液轉染BMSc，利用經(jīng)轉染的BMSc修復犬下頜骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm骨缺損。 修復實驗也分為4 組：經(jīng)轉染細胞+ FG修復組；未經(jīng)轉染細胞+ FG修復組；

6、 單純FG生物材料修復組；空白組，未加任何填充材料。采用大體觀察、X線觀察、組織學觀察、免疫組織化學等方法對骨缺損修復情況進行對比檢測。 研究結果發(fā)現(xiàn)： （1）構建的Nell-1 逆轉錄病毒載體中外源基因方向、序列均正確、無堿基缺失及突變現(xiàn)象。原位雜交、RT-PCR以及免疫組織化學檢測顯示經(jīng)PLNCX2- Nell-1 病毒液感染的BMSc中有較強的陽性結果出現(xiàn)，而PLNCX2空載體轉染的BMSc以及未轉染的BMSc

7、中極少見陽性表達結果。 （2）經(jīng)PLNCX2- Nell-1 病毒介導的基因轉染的犬BMSc增殖能力無明顯改變，其細胞伸展面積和細胞粘附力提高，同時其合成膠原、ALP、BGP、層粘連蛋白的能力能夠得到顯著提高，與PLNCX2病毒液轉染、未經(jīng)轉染的BMSc相比有顯著性差異。 （3）PLNCX2- Nell-1 重組病毒液與FG生物材料復合修復組可見在缺損處有骨性連接形成，組織學觀察見有大量新生骨組織形成，而PLNCX2

8、病毒液+FG修復組、單純材料修復組和空白組組均未見骨性連接形成，僅在部分骨缺損兩斷段形成少量骨組織。 （4）大體觀察、X 線、組織學檢測分析結果證實經(jīng)轉染的BMSc 修復骨缺損的成骨速度和成骨量均優(yōu)于未轉染BMSc 修復組，單純FG 生物材料修復組和空白組中均未見骨缺損得到修復。 根據(jù)以上結果，得出以下結論： （1）采用逆轉錄病毒介導的方法可以將Nell-1 轉染至BMSc 中，并有外源Nell-1 的表達。

9、 （2）PLNCX2- Nell-1 基因轉染能夠促進體外培養(yǎng)的BMSc向成骨細胞轉化，增強其細胞粘附力，并對其增殖能力沒有顯著影響。 （3）采用PLNCX2- Nell-1 重組病毒液與生物材料復合的方法能夠修復犬下頜骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm缺損。 （4）PLNCX2- Nell-1 基因轉染能夠提高BMSc形成組織工程化骨組織和修復骨缺損的能力。 （5）采用Nell-1 基因轉