富集骨髓基質(zhì)干細胞復合生物材料修復犬眼眶骨缺損.pdf

1、眼眶遭受外傷、腫瘤及炎癥等侵害時易造成骨性結(jié)構(gòu)的破壞，引起眶壁骨質(zhì)缺損，導致面中部畸形、眼球位置及視功能異常。目前臨床應(yīng)用的各種修復材料均存在一定缺陷，而組織工程技術(shù)為眼眶骨修復治療帶來了希望。但目前組織工程骨構(gòu)建中的細胞來源多靠體外培養(yǎng)獲得，存在耗時、安全性及經(jīng)濟耗費等問題。如何快速、安全并且有效地把骨髓血中具有成骨能力的干細胞分離濃縮，并有效的與生物支架材料復合是組織工程技術(shù)能夠大規(guī)模應(yīng)用于臨床的前提條件。
　　 目的：

2、r>　　 應(yīng)用紅細胞裂解技術(shù)將骨髓血中具有成骨能力的干細胞快速分離濃縮，經(jīng)自制體外干細胞-材料融合裝置與β-磷酸三鈣(β-TCP)支架材料復合，構(gòu)建組織工程骨，探討修復眼眶骨缺損的可行性。
　　 方法：
　　 1.將骨髓血經(jīng)紅細胞裂解液處理后，獲得的有核細胞行體外成骨誘導培養(yǎng)，對其中的骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)進行細胞形態(tài)學及成骨活性檢測，分析紅細胞裂解液對干細胞生理特性的影響。
　　 2.將骨髓血中通過紅細

3、胞裂解處理獲得的有核細胞，經(jīng)體外自制干細胞-材料融合裝置，與β-TCP支架材料進行體外復合，通過掃描電鏡觀察細胞在支架內(nèi)分布及貼附情況。將該細胞-材料復合體植入犬背部皮下，植入后1個月取材進行組織學檢測，分析其異位成骨能力。
　　 3.經(jīng)紅細胞裂解處理獲得的干細胞與β-TCP材料體外復合構(gòu)建組織工程骨，對犬眼眶壁骨缺損進行修復實驗。對未經(jīng)處理的骨髓血及紅細胞裂解液處理后的細胞懸液行有核細胞計數(shù)及堿性磷酸酶(ALP)染色陽性細胞集

4、落的計數(shù)。在術(shù)后1周、4周、12周和24周分別進行螺旋CT檢查和三維重建觀察。術(shù)后24周取材，進行大體觀察、Micro-CT檢查及組織學觀察，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價修復效果。
　　 結(jié)果：
　　 1.犬骨髓血經(jīng)紅細胞裂解液處理后，干細胞經(jīng)體外成骨誘導培養(yǎng)后，ALP、鈣結(jié)節(jié)染色呈強陽性，表達成骨標志性蛋白(OCN，OPN，BSP，Cbfal、I型膠原等)，與未經(jīng)紅細胞裂解液處理的干細胞在成骨能力及成骨活性等方面無明顯差異

5、。
　　 2.干細胞經(jīng)自制體外干細胞-材料融合裝置與β-TCP復合2小時后，掃描電鏡觀察材料內(nèi)部有干細胞均勻分布，且細胞貼附良好。同時，構(gòu)建的組織工程骨具有良好的異位成骨能力。
　　 3.通過計算濃縮前后干細胞及有核細胞計數(shù)，材料內(nèi)有核細胞濃度及干細胞濃度分別提高53倍及49倍;實驗組CT影像隨訪可見材料逐漸吸收并伴有新骨的形成，同時伴有骨改建的發(fā)生;Micro-CT和組織學檢查顯示實驗組新生骨與周圍眶壁已形成骨性連接，

6、實驗組有6側(cè)(75％)眼眶骨性缺損基本被完全修復，而對照組僅有一例只在缺損最大直徑形成骨性連接，統(tǒng)計結(jié)果有顯著性差別(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.骨髓血經(jīng)紅細胞裂解液處理后獲得的BMSCs生物活性未受影響，能夠穩(wěn)定向成骨細胞分化并保持良好成骨活性及增殖能力。
　　 2.自設(shè)計體外材料-干細胞復合裝置能夠快速、高效的將BMSCs與支架材料復合。
　　 3.經(jīng)自設(shè)計體外材料-干細胞復合裝置構(gòu)建的