富集骨髓干細(xì)胞復(fù)合磷酸三鈣移植促進(jìn)骨修復(fù).pdf

1、研究背景和目的:骨修復(fù)是長(zhǎng)期以來臨床骨科普遍存在、并急需解決的問題。自體骨或異體骨移植雖然為骨修復(fù)提供了途經(jīng)，但都存在一定缺陷。目前應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)和組織工程的手段促進(jìn)骨修復(fù)的研究受到廣泛重視，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)展迅速。但由于包括倫理學(xué)在內(nèi)的種種因素，其臨床應(yīng)用一直未能順利開展。本研究避開技術(shù)上與倫理學(xué)方面限制干細(xì)胞技術(shù)在臨床應(yīng)用的多種因素，首次研究在手術(shù)同期，應(yīng)用富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)快速復(fù)合β-磷酸三鈣(β-TCP)移植促進(jìn)骨

2、修復(fù)的可行性、效果、臨床價(jià)值及影響因素。 方法整個(gè)研究分為五部分： 1．快速富集技術(shù)對(duì)人骨髓MSCs影響的研究 通過測(cè)定富集前后骨髓有核細(xì)胞(NCs)和骨髓MSCs數(shù)量變化，骨髓MSCs增殖活性、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞分布(細(xì)胞表面標(biāo)志物)情況的變化，和MSCs成骨活性的改變，來綜合評(píng)價(jià)富集技術(shù)對(duì)人骨髓MSCs的影響。 2．富集骨髓MSCs快速復(fù)合多孔β-TCP的體外研究。 應(yīng)用負(fù)壓技術(shù)將富集骨髓M

3、SCs與多孔β-TCP復(fù)合2h、4h、24h和4811后，掃描電鏡觀察富集MSCs在β-TCP中的黏附情況，測(cè)定不同復(fù)合時(shí)間MSCs的D-葡萄糖代謝情況來觀察時(shí)間對(duì)復(fù)合效果的影響；倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合材料表面和內(nèi)部MSCs的生長(zhǎng)狀況；利用測(cè)定復(fù)合β-TCP和單純平面培養(yǎng)的骨髓MSCs培養(yǎng)基中D-葡萄糖和L-乳酸含量的變化，以及DNA相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)，觀察比較MSCs復(fù)合β-TCF培養(yǎng)與單純平面培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況。 3．富

4、集人骨髓MSCs復(fù)合多孔β-TCP在裸鼠體內(nèi)異位成骨的研究。 隨機(jī)分實(shí)驗(yàn)組(富集骨髓MSCs／β-TCP)和對(duì)照組(單純?chǔ)?TCP)，將β-TCP顆粒材料分別植入12只裸鼠右股后肌袋內(nèi)，于4、8周分別進(jìn)行大體觀察、材料中部掃描電鏡觀察、x線觀察、骨密度測(cè)定和組織學(xué)觀察。應(yīng)用圖像軟件對(duì)X線片中材料組織塊的相對(duì)密度進(jìn)行測(cè)量，觀察降解和成骨情況。 4．富集骨髓MSCs復(fù)合多孔β-TCP促進(jìn)羊脊柱后路融合的實(shí)驗(yàn)研究建立羊后路脊柱

5、融合動(dòng)物模型，將12只羊的6個(gè)腰椎，共36節(jié)段，按植入材料隨機(jī)分為A組(自體富集骨髓MSCs/β-TCP)、B組(單純?chǔ)?TCP)和C組(自體髂骨)。于術(shù)后12、24周分批取樣，分別進(jìn)行大體檢查判斷融合情況、X線觀察材料降解情況、CT橫斷掃描進(jìn)行融合評(píng)分、無間隔掃描計(jì)算新生骨體積、骨密度測(cè)量融合區(qū)的礦化密度、生物力學(xué)檢測(cè)融合節(jié)段的最大載荷、剛度以及組織學(xué)觀察新骨形成率和β-TCP材料的降解率。 5．富集骨髓MSCs復(fù)合多孔β-T

6、CP促進(jìn)骨修復(fù)的臨床研究應(yīng)用富集骨髓MSCs復(fù)合多孔β-TCP共治療臨床患者47例(脊柱融合40例、骨不連6例、骨囊腫l例)，通過C0BE 2991<,’TM>血細(xì)胞分選系統(tǒng)，快速富集骨髓MSCs，在術(shù)中復(fù)合多孔β-TCP后，進(jìn)行回植治療。通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)染色陽性的細(xì)胞集落(CFU)數(shù)量變化及來評(píng)價(jià)富集MSCs效率，觀察年齡、性別和原發(fā)病種對(duì)骨髓MSCs的影響，分析骨髓NCs和MSCs富集倍數(shù)的相關(guān)性。并通過細(xì)

7、菌學(xué)檢測(cè)，臨床隨訪，x線、CT檢查評(píng)價(jià)安全性和治療效果。 結(jié)果： 1．富集前后骨髓MSCs均增殖良好。富集后骨髓NCs和MSCs數(shù)量明顯增加，P<0.01。生長(zhǎng)曲線顯示：富集前后MSCs增殖活力無顯著變化，P>0.05。富集后增殖期MSCs相對(duì)比例減少，P<0.05。富集前后MSCs正常、凋亡、機(jī)械損傷和壞死細(xì)胞的比例均無顯著變化，P>0.05。富集后CD45-、CD34-/CD45-的細(xì)胞相對(duì)比例有所減少，P<0.0

8、5。富集前后原代貼壁細(xì)胞中CD34-、CD45-、CD34-/CD45-、CDl05+、CD90+和CD44+的細(xì)胞相對(duì)比例無顯著的差異，P>0.05。富集后原代骨髓MSCs的ALP、V0nK0ssa染色顯示成骨活性增強(qiáng)。 2．掃描電鏡觀察快速復(fù)合2h已有部分MSCs貼壁，24h后貼壁細(xì)胞最多，48h已有膠原基質(zhì)分泌；經(jīng)體外培養(yǎng)，復(fù)合后多孔β-TCP內(nèi)部有較多MSCs生長(zhǎng)。復(fù)合24h組的富集MSCs對(duì)D-葡萄糖的消耗最多。倒置顯

9、微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察，富集MSCs可在多孔β-TCP材料表面和深部孔隙中良好生長(zhǎng)。復(fù)合β-TCP的MSCs對(duì)D-葡萄糖和L一乳酸代謝顯著高于單純平面培養(yǎng)的MSCs，P<0.05。DNA相對(duì)定量顯示復(fù)合β-TCP組比單純平面培養(yǎng)組，MSCs的數(shù)量更多，P<0.05。 3.實(shí)驗(yàn)組(富集骨髓MSCs／β-TCP)和對(duì)照組(單純?chǔ)?TCP)裸鼠傷口均良好愈合。掃描電鏡觀察，在多孔β-TCP的中心，實(shí)驗(yàn)組有大量的組織細(xì)胞生長(zhǎng)，而對(duì)照

10、組基本無細(xì)胞生長(zhǎng)。x線觀察，8周時(shí)材料密度下降，實(shí)驗(yàn)組材料組織塊的相對(duì)密度值比對(duì)照組下降更明顯。與實(shí)驗(yàn)組DEXA值下降明顯(P<0.05)相一致。脫鈣組織學(xué)觀察：8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組有3／6例發(fā)現(xiàn)異位成骨，對(duì)照組無成骨現(xiàn)象。 4.富集后羊骨髓MSC：s顯著增加，P<0.01。大體觸摸判斷羊脊柱融合，A組(富集骨髓MSCs／β-Tcp)92％(11／12)，B組(單純?chǔ)?TCP)58％(7／12)，C組(自體骨)75％(9／12)，P>

11、0.05。CT掃描測(cè)定脊柱融合率A、B、C三組分別為92％(11／12)、58％(7／12)，100％(12／12)，P<0.05。X線觀察，4周起A、B組融合區(qū)密度下降明顯，第12周后，A組密度有所回升。C組自第4周起融合區(qū)密度逐漸上升。CT掃描12周時(shí)A、C兩組椎板外側(cè)有大量的新骨形成，B組新骨形成少。CT對(duì)新生骨組織體積重建，A組>B組，P<0.05。 DExA檢測(cè)結(jié)果與X線觀察一致，4周時(shí)A、B組植骨區(qū)的BMD值>C組B

12、MD值，P<0.05。12周時(shí)A組>C組，P<0.05,24周時(shí)，三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4周起，A、B組BMD值隨時(shí)間有先下降再回升的趨勢(shì)，而C組BMD值隨時(shí)間顯著上升。生物力學(xué)檢測(cè)融合節(jié)段的最大耐受載荷，12周時(shí)A、C組>B組，P<0.05，24周時(shí)，三組間均值大小為，A>C組>B組，但P>0.05。融合節(jié)段剛度，12周時(shí)三組均值順序?yàn)?，C組>A組>B組，P>0.05。24周時(shí)，三組剛度均有顯著上升，P<0.05，且C組>B組，P<0.

13、05。 脫鈣組織學(xué)觀察，12周時(shí)A、C組融合區(qū)有大量新生板層骨組織，B組新生骨組織少，24周時(shí)，A、C組融合區(qū)骨改建明顯，B組骨小梁結(jié)構(gòu)較差。不脫鈣組織學(xué)觀察，12周時(shí)，A組同時(shí)可觀察到殘留材料位于新生骨組織的表面和深部，B組材料僅見于新生骨組織表面，C組可見新生骨組織對(duì)移植骨的爬行替代。骨組織形態(tài)學(xué)計(jì)量，新骨形成率A、C組>B組，P<0.01。β-TCP降解較快，12周時(shí)A、B組中β-TCf的降解率為93％和92％。

14、5．臨床治療中獲得骨髓血約250±37ml／例，富集回收約50±19ml／例，骨髓MSCs回收率約占78％，骨髓MSCs由(231±251)／ml濃縮至(743±651)／ml。骨髓MSCs的自然對(duì)數(shù)與年齡成線性負(fù)相關(guān)(r=-0.4910，P<0.05)，NCs的自然對(duì)數(shù)與年齡相關(guān)性不大(r=-0.0469、P>O.05)。男、女性的骨髓NCs和MSCs數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別 (P>0.05)。骨髓MSCs數(shù)，骨折組>退變組(P<0.05)。

15、通過富集，NCs與MSCs的增長(zhǎng)倍數(shù)成線性正相關(guān)(r=0.4054，P<0.05)。臨床病例隨訪13.5±6.3個(gè)月，總體有效率為95.6％。富集血樣細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陰性率100％。4例術(shù)后傷口有滲出或腫脹，均自行痊愈。 結(jié)論： 1．體外快速富集技術(shù)，提高單位體積內(nèi)的骨髓NCs和MSCs的數(shù)量。不影響MSCs的增殖活力，不增加MSCs的凋亡、機(jī)械損傷或壞死的比例。通過富集技術(shù)獲得的骨髓血是一富含MSCs的多種細(xì)胞成分的混合體

16、，體外誘導(dǎo)觀察證實(shí)其成骨活性比原始骨髓血更強(qiáng)。 2．富集骨髓MSCs快速復(fù)合β-rcP，可使骨髓MSCs進(jìn)入多孔β-TCP內(nèi)部，復(fù)合2h即有細(xì)胞黏附于材料內(nèi)壁，復(fù)合24h黏附效率較高。體外培養(yǎng)，富集骨髓MSCs可在多孔β-TCP內(nèi)部、表面生長(zhǎng)增殖，比單純平面培養(yǎng)的富集MSCs生長(zhǎng)代謝更旺盛、細(xì)胞增殖更明顯。通過該方法可在體外快速構(gòu)建富集MSCs／β-TCP生物活性材料。 3．富集人骨髓MSCs／β-TCP顆粒具有較好的生

17、物相容性，富集MSCs通過復(fù)合能進(jìn)入多孔β-TCP內(nèi)部，并在裸鼠體內(nèi)增殖生長(zhǎng)：8周時(shí)，裸鼠體內(nèi)富集MSCs／β-TCP材料密度顯著下降，接近骨密度，具有異位成骨能力。 4．自體富集骨髓MSCs／β-TCP可促進(jìn)羊脊柱后路融合，其成骨能力、對(duì)羊脊柱后路融合率與自體骨相當(dāng)，明顯優(yōu)于單純?chǔ)?TCP材料。可能主要?dú)w因于富集骨髓MSCs的自身成骨潛能與多孔β-TCP骨傳導(dǎo)性結(jié)合所產(chǎn)生的成骨活性。在β-TCP快速降解的同時(shí)，富集骨髓MSCs