IL-17在骨髓干細胞促進肝損傷修復中的作用研究.pdf

1、【背景】
　　肝硬化是由各種慢性肝臟損害所導致的肝臟疾病晚期階段。對于失代償期肝硬化,內科常規(guī)的保肝和對癥治療不能延長患者生存期,原位肝移植是唯一有效的治療手段,但受供肝缺乏、費用高昂等因素的嚴重限制。近年來,隨著干細胞相關研究的不斷深入,自體骨髓源干細胞(Bone marrow-derived stem cells,BMSCs)用于人類多種疾病的治療取得了重要進展。越來越多的臨床探索性研究發(fā)現,自體BMSCs移植能有效地提升失代

2、償期肝硬化患者的肝功能。有關干細胞促進肝功能恢復的機理,大多數學者認為,除了轉分化為肝細胞或與內源肝細胞融合外,干細胞主要通過調控機體免疫狀態(tài)或肝臟免疫微環(huán)境而發(fā)揮作用。然而,自體BMSCs移植使機體免疫狀態(tài)發(fā)生了什么樣的變化仍未見報道。
　　本課題組前期進行了自體干細胞移植治療失代償期肝硬化的臨床探索性研究。我們利用粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)將BM

3、SCs動員到外周血中,再從外周血中分離出干細胞,最后將獲得的干細胞通過血管介入回輸至患者肝動脈。針對失代償期肝硬化患者的臨床隨機對照研究表明,與僅接受G-SCF處理的患者相比,接受自體干細胞移植的患者肝功能顯著提高。至2012年12月,我們對416例失代償期肝硬化患者進行了自體干細胞移植治療,隨訪結果表明,干細胞治療顯著提高了患者的3年生存率(87％,對照組為29%)。我們對42例接受干細胞移植治療的患者進行了免疫相關指標的檢測,結果發(fā)

4、現:在干細胞治療后第1、3、6、9、12月,患者外周血IL-17水平呈持續(xù)下降趨勢,并與患者肝功能指標的變化呈正相關。提示IL-17可能與BMSCs促進肝功能恢復有關。
　　本研究將采用四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)制備小鼠肝損傷模型,并對肝損傷小鼠進行同源BMSCs移植治療。利用這一模型,探討IL-17在CCl4誘導小鼠肝損傷和BMSCs改善肝損傷過程中的作用,為闡明BMSCs促進肝病患者肝功能恢

5、復的機理提供理論依據。
　　【目的】
　　1.明確IL-17在CCl4誘導小鼠肝損傷中的作用;
　　2.闡明IL-17在BMSCs促進小鼠肝損傷修復中的作用。
　　【方法】
　　1.采用CCl4腹腔注射誘導小鼠肝損傷。在肝損傷誘導過程中,H&E和天狼星紅染色檢測小鼠肝臟炎癥和纖維化程度,血漿生化檢測丙氨酸轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB),同

6、時采用ELISA檢測小鼠外周血IL-17水平,Real-timePCR檢測小鼠肝組織表達促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-17F以及IL-17RA和IL-17RC的水平,流式細胞術檢測肝內單核細胞中Th17細胞的百分比;
　　2.給予特異性抗小鼠IL-17抗體(Anti-IL-17mAb)或重組小鼠(Rm)IL-17干預CCl4誘導小鼠肝損傷過程,H&E和天狼星紅染色檢測小鼠肝臟炎癥和纖維化程

7、度,血漿生化檢測ALT、ALB,Real-timePCR檢測肝纖維化相關因子基質金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3,MMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)和TGF-β1的表達,免疫組化、Real-time PCR和Western blot檢測肝組織表達α-SMA的情況;
　　3.將同品系小鼠BMSCs經尾靜脈移

8、植給CCl4誘導的肝損傷小鼠(5×106BMSCs/只),采用ELISA檢測小鼠外周血IL-17水平,Real-timePCR檢測小鼠肝組織IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC及IL-23p19的表達水平,流式細胞術檢測肝內單核細胞中Th17細胞的百分比;
　　4.給予Anti-IL-17mAb和RmIL-17因子干預BMSCs治療CCl4誘導小鼠肝損傷的過程,H&E和天狼星紅染色檢測肝組織炎癥和纖維化程度,

9、Real-timePCR檢測肝內膠原層蛋白collagen-1的表達,血清生化檢測小鼠肝功能(ALT和ALB水平)。
　　【結果】
　　1.IL-17與小鼠肝損傷過程密切相關
　　H&E、天狼星紅染色和血清生化檢測結果顯示,連續(xù)6周CCl4腹腔注射成功誘導出小鼠肝損傷模型,表現為肝組織內大量炎性細胞浸潤、纖維化形成,外周血ALT升高而ALB水平顯著降低。ELISA、Real-timePCR和流式細胞術檢測發(fā)現,在CCl

10、4誘導肝損傷過程中,外周血IL-17水平和肝組織內IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平逐漸升高,而肝組織內Th17細胞百分比和IFN-γ的表達水平無明顯變化。當撤除CCl4后,小鼠肝損傷逐漸恢復,外周血IL-17水平和肝組織內IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平也逐漸恢復至幾乎正常。
　　2.IL-17促

11、進CCl4誘導小鼠肝損傷
　　在用CCl4制備小鼠肝損傷過程中,和僅給予CCl4腹腔注射組相比,聯合注射RmIL-17能顯著加重小鼠肝損傷,而聯合注射Anti-IL-17mAb卻顯著減輕CCl4誘導的肝損傷。Real-timePCR、免疫組化和Westernblot結果顯示,與單純使用CCl4相比,聯合使用CCl4和RmIL-17顯著增加了肝組織內MMP3、TIMP1、TGF-β1、α-SMA的表達,而聯合使用CCl4和Anti-

12、IL-17mAb卻抑制了MMP3、TIMP1、TGF-β1、α-SMA的表達。
　　3.同源BMSCs下調小鼠IL-17表達水平
　　同源BMSCs移植治療能有效改善CCl4誘導的小鼠肝損傷。在BMSCs促進肝損傷恢復的同時,小鼠外周血IL-17水平也明顯下降,逐漸恢復至幾乎正常水平;肝組織內IL-23p19、IL-17A、IL-17F、IL-17RA和IL-17RC的表達也顯著下降;但是肝內Th17細胞百分比無明顯變化。<

13、br>　　4.IL-17在BMSCs促進CCl4誘導的小鼠肝損傷修復過程中起重要作用
　　在BMSCs移植治療CCl4誘導的小鼠肝損傷過程中,加入外源性RmIL-17顯著減弱了BMSCs的治療效果。與BMSCs治療組相比,BMSCs聯合RmIL-17組小鼠的肝組織炎癥和纖維化顯著加重。采用Anti-IL-17mAb對肝損傷小鼠治療,結果發(fā)現其能顯著減輕肝組織炎癥和纖維化程度,且與BMSCs移植治療組無明顯差異。
　　【結論】