羊水干細胞在皮膚損傷修復(fù)中的作用及機制研究.pdf

1、皮膚指身體表面包在肌肉外面的組織，是人體最大的器官，主要承擔著保護身體、排汗、感覺冷熱和壓力等功能。皮膚覆蓋全身，它使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲。當由于外界損傷或疾病等因素造成皮膚缺損時，其危害可以是致命的。
　　皮膚組織工程是利用生物學(xué)和工程學(xué)原理，構(gòu)建出用于修復(fù)、維持和改善損傷組織功能的替代物，形成人工再生的皮膚等同物，移植于需要修復(fù)、重建的皮膚病損處。隨著干細胞和組織工程研究不斷深入,干

2、細胞作為種子細胞在組織工程中的價值得到逐步體現(xiàn)。尋找新型種子細胞在國內(nèi)外都是皮膚損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的核心和熱點。
　　羊水細胞由于其所處的特殊的解剖位置，長期以來受到了人們的重視。對于羊水細胞的研究最早可追溯至20世紀初，隨著羊膜穿刺技術(shù)和細胞培養(yǎng)條件的日趨成熟，羊水細胞的培養(yǎng)成功率也得到了提高，羊水細胞的研究也得到了迅速的發(fā)展。羊水細胞在基因突變導(dǎo)致的染色體異常、遺傳病和先天性代謝異常等疾病的產(chǎn)前診斷中發(fā)揮著重要作用。近年來研究發(fā)

3、現(xiàn)羊水細胞中含有多種干細胞的標記物，且在體外通過特殊的誘導(dǎo)微環(huán)境能夠分化成多種不同類型的細胞，這使羊水來源干細胞成為干細胞研究的一個新的熱點。因此羊水作為干細胞的一個新的來源，將為干細胞的研究揭開一個新的研究領(lǐng)域，為組織工程提供新的種子細胞來源。
　　本研究皆在建立人羊水干細胞體外分離和培養(yǎng)方法，并分析其生物學(xué)特性，利用羊水干細胞的高增殖和多向分化潛能，開展羊水干細胞體外向表皮角質(zhì)細胞的分化研究，并在基因、蛋白、超微結(jié)構(gòu)等方面驗證

4、；在此基礎(chǔ)上進一步利用人羊水干細胞的低免疫原性的特征，構(gòu)建小鼠皮膚損傷模型，展開羊水干細胞對皮膚損傷修復(fù)的研究，觀察植入細胞的存活、遷移、分化及小鼠創(chuàng)面的修復(fù)，探討其加快小鼠創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵分子機制。同時，初步探討羊水干細胞在真皮層汗腺損傷修復(fù)中的作用，為皮膚組織工程提供理想的種子細胞，也為臨床治療大面積燒傷病人提出新方案，具有研究的創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價值。
　　第一部分人羊水干細胞的體外培養(yǎng)方法和生物學(xué)特征鑒定及其向表皮角質(zhì)細胞分

5、化的研究
　　目的：建立體外分離、提取、培養(yǎng)和純化人羊水干細胞的方法，并對其生物學(xué)特性進行鑒定，在此基礎(chǔ)上，定向誘導(dǎo)羊水干細胞分化為表皮角質(zhì)細胞，并對其生物學(xué)特性及功能進行鑒定。
　　方法：選取孕19-22周健康婦女羊膜穿刺之羊水組織，在無菌條件下用CD117磁珠分選，分選出陽性細胞，1200rpm離心后加入羊水干細胞培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天全量換液。倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的羊水干細胞的形態(tài)，增殖情況

6、。RT-PCR檢測不同傳代次數(shù)羊水干細胞、胚胎干細胞、成體干細胞標志基因的表達；流式細胞術(shù)檢測其表面標志物；細胞連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)分析羊水干細胞的傳代增殖能力。待細胞生長至匯合率為70%時，進行傳代培養(yǎng)。取第三代的羊水干細胞，以2×104個/皿的密度接種于6cm細胞培養(yǎng)皿中，收集培養(yǎng)過人角質(zhì)細胞的KGM2培養(yǎng)基，用0.22μm的濾器過濾，收集到的培養(yǎng)基為條件培養(yǎng)基CM（Conditioned Medium）及添加誘導(dǎo)因子的角質(zhì)化細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)

7、培養(yǎng)基KBM2為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細胞生長至匯合率為70%-80%時，對細胞消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化細胞的形態(tài)變化，待細胞出現(xiàn)上皮樣克隆時，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中額外添加 BMP4和維生素 C，待誘導(dǎo)分化30天后得到羊水干細胞來源的的角質(zhì)細胞。RT-PCR檢測、免疫熒光染色分別在基因、蛋白水平檢測誘導(dǎo)后細胞的生物學(xué)特征；流式細胞術(shù)檢測羊水干細胞的分化率；透射電鏡技術(shù)觀察細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；三維氣液組織培養(yǎng)方法及

8、H&E染色檢測分化后的羊水干細胞形成復(fù)層上皮的能力，免疫組織化學(xué)分析誘導(dǎo)分化的羊水干細胞形成復(fù)層上皮中各個不同層次的標志蛋白的表達。
　　結(jié)果：（1）羊水干細胞表達表皮干細胞標志（K19和β1-integrin）、胚胎干細胞的標志（Oct4、Sox-2、c-Myc、Klf4、Rex-1和Nanog）和上皮細胞的標志（K8和K18）及B7家族負性分子B7H1、B7H2、B7H3和B7H4及BTLA，但并不表達角質(zhì)細胞的標志（K14）

9、和正性共刺激分子CD40、CD80和CD86；T淋巴細胞體外增殖實驗顯示，與羊水干細胞混合培養(yǎng)的 T淋巴細胞增殖較前明顯減緩，而加入B7H1和B7H4阻斷性抗體后，T淋巴細胞數(shù)量明顯增加，且阻斷B7H4后的作用更為顯著；(2)羊水干細胞誘導(dǎo)分化獲得的角質(zhì)細胞呈典型的上皮樣形態(tài)，排列規(guī)則且緊密，邊界清晰，類似鋪路石狀，在基因和蛋白水平均表達正常角質(zhì)化細胞的標志K5和K14，且分化率約為35%；(3)羊水干細胞分化而來的角質(zhì)細胞保留了羊水干

10、細胞的高核質(zhì)比，且具有羊水干細胞不具有的特殊細胞器：張力原纖維；（4）三維氣液培養(yǎng)及H&E染色結(jié)果顯示羊水干細胞來源的角質(zhì)細胞能夠進一步分化成熟，形成復(fù)層上皮，表達角質(zhì)細胞成熟的標志K10，Involucrin。
　　結(jié)論：從羊膜穿刺健康樣本，經(jīng)過CD117磁珠分選后，成功獲得羊水干細胞，其干性介于胚胎干細胞與成體干細胞之間，具有向表皮角質(zhì)細胞的分化潛能，表達B7家族負性分子，具有免疫調(diào)節(jié)作用及高增殖能力。體外誘導(dǎo)羊水干細胞獲得的

11、角質(zhì)細胞在基因和蛋白水平表達角質(zhì)化細胞標志K5和K14，并具有角質(zhì)細胞典型的細胞器：張力原纖維，并且能進一步分化成熟，形成復(fù)層上皮，表達角質(zhì)細胞成熟的標志。因此，羊水干細胞可以做為皮膚損傷修復(fù)的有價值的種子細胞。
　　第二部分人羊水干細胞參與小鼠皮膚損傷修復(fù)的研究及初步機制探討
　　目的：建立小鼠背部皮膚損傷模型，利用羊水干細胞進行移植修復(fù)，觀察移植后實驗動物皮膚損傷修復(fù)情況，羊水干細胞在小鼠體內(nèi)的存活，細胞的增殖及分化并分

12、析其可能的修復(fù)機制，為進一步深入研究羊水干細胞在皮膚損傷修復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ)，也為臨床治療提出新方案。
　　方法：利用穩(wěn)定傳代的羊水干細胞，用慢病毒轉(zhuǎn)染了GFP報告基因，病毒滴度為6.5×106 IU/ml，且流式檢測其轉(zhuǎn)化效率，確保后期實驗的準確性。取鼠齡為4-6周的雄性 BALB/c小鼠，將其背部的毛發(fā)用電動理發(fā)器剔除后在構(gòu)建直徑為1cm的圓形皮膚缺損創(chuàng)面，在創(chuàng)面邊緣注射入轉(zhuǎn)染GFP的羊水干細胞，羊水干細胞的數(shù)量為5 x106

13、,將轉(zhuǎn)染GFP的相同數(shù)量的成纖維細胞及假手術(shù)組作為對照，并將手術(shù)后的小鼠單獨飼養(yǎng)，觀察至小鼠完全蘇醒并能自由活動，每隔一天觀察，并未出現(xiàn)異常及明顯的免疫排斥反應(yīng)。用UTHSCSA ImageTool軟件計算小鼠創(chuàng)面大小，并作圖分析；分別取小鼠創(chuàng)面4天的肉芽組織及14天的修復(fù)組織進行H&E染色，觀察炎癥細胞、血管的新生及創(chuàng)面的修復(fù)情況；流式細胞術(shù)及免疫熒光染色技術(shù)檢測植入小鼠創(chuàng)面細胞的存活情況及分化情況；Real-Time PCR分別檢測

14、不同天數(shù)小鼠創(chuàng)面皮膚修復(fù)因子及炎癥相關(guān)因子的表達。利用小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)B7H4分子在羊水干細胞中的表達；制造皮膚損傷模型，在創(chuàng)面邊緣注射入下調(diào)B7H4的羊水干細胞，其數(shù)量為5 x106,將轉(zhuǎn)染GFP的成纖維細胞及正常羊水干細胞組作為對照，分別取不同組別的小鼠創(chuàng)面進行免疫化學(xué)、流式細胞術(shù)檢測浸潤的T淋巴細胞數(shù)量；Real-Time PCR分別檢測不同天數(shù)不同組別小鼠創(chuàng)面皮膚修復(fù)因子及炎癥相關(guān)因子的表達，采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟

15、件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（X± s）表示，組間兩兩對比進行t檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：(1)羊水干細胞組在移植細胞7天后，小鼠背部創(chuàng)面面積明顯小于成纖維細胞組和假手術(shù)組，術(shù)后14天，羊水干細胞組小鼠背部創(chuàng)面修復(fù)明顯加快，對照組創(chuàng)面愈合也較為明顯；術(shù)后21天，羊水干細胞組小鼠背部創(chuàng)面完全愈合，對照組創(chuàng)面較前縮小，但背部仍顯明顯創(chuàng)面；（2）羊水干細胞移植組新生表皮較成纖維細胞組和假手術(shù)組更厚，并且

16、有比較多的新生血管和成纖維細胞，未見浸潤的炎癥細胞，而成纖維細胞移植組和假手術(shù)組新生表皮較薄，有較多的炎癥細胞；術(shù)后14天，羊水干細胞移植組出現(xiàn)明顯的真皮乳頭結(jié)構(gòu)和毛囊等皮膚附屬器；（3）隨著修復(fù)的進行，羊水干細胞在體內(nèi)的存在逐漸較少。熒光檢測結(jié)果顯示，羊水干細胞組和成纖維細胞組在術(shù)后7天仍有部分的GFP陽性細胞存在；術(shù)后21天，羊水干細胞組僅有個別GFP陽性細胞存在；(4)在修復(fù)早期，修復(fù)相關(guān)因子（bFGF，VEGF，CXCL12，T

17、GF-β1，KGF）在羊水干細胞中的表達明顯高于成纖維細胞和假手術(shù)組，隨著修復(fù)的進行，它們的表達逐漸下降，21天時，表達量與正常小鼠皮膚的表達接近，而成纖維細胞組和假手術(shù)組的修復(fù)因子在7天時表達明顯低于羊水干細胞組，21天才到達最高；而早期的炎癥相關(guān)因子（IL-1β，IL-6，TNF-α，Cox2及Mac3）在成纖維細胞組和假手術(shù)組的表達明顯高于羊水干細胞組，隨著修復(fù)的進行，各組的表達都逐漸下降，到達21天，羊水干細胞中的表達接近于正常

18、小鼠皮膚的表達，而成纖維細胞組和假手術(shù)組在21天時仍然高于羊水干細胞組；(5)經(jīng)小分子RNA干擾后，羊水干細胞B7H4的表達明顯下降，與下調(diào)B7H4的羊水干細胞共培養(yǎng)的 T淋巴細胞增殖數(shù)量明顯增加，由此顯示羊水干細胞表達的共刺激分子B7H4是下調(diào)T細胞體內(nèi)外增殖的關(guān)鍵因子;（6）而免疫組化實驗結(jié)果也顯示，下調(diào) B7H4的羊水干細胞組有較多的浸潤 T淋巴細胞，流式細胞儀檢測了浸潤 T淋巴細胞的比例發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞移植組、下調(diào) B7H4羊水

19、干細胞移植組浸潤的T淋巴細胞數(shù)量明顯高于羊水干細胞組；（7）相應(yīng)生物因子檢測結(jié)果表明，在修復(fù)早期，修復(fù)相關(guān)因子在羊水干細胞中的表達明顯高于成纖維細胞和下調(diào)B7H4羊水干細胞移植組，隨著修復(fù)的進行，它們的表達逐漸下降，而成纖維細胞組和下調(diào)B7H4羊水干細胞移植組因子的表達在21天時才到達最高；同時還發(fā)現(xiàn)，在早期，炎癥相關(guān)因子在成纖維細胞組和下調(diào)B7H4羊水干細胞組的表達明顯高于羊水干細胞組，隨著修復(fù)的進行，各組的表達都逐漸下降，而成纖維細

20、胞組和下調(diào)B7H4羊水干細胞組的表達在21天時仍然高于羊水干細胞組。
　　結(jié)論：羊水干細胞能夠明顯加快小鼠創(chuàng)面的愈合，促進血管形成，調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，提前形成皮膚附屬器；在修復(fù)早期，羊水干細胞能夠在體內(nèi)直接誘導(dǎo)分化成為表皮角質(zhì)細胞，表達角質(zhì)細胞標志；隨著修復(fù)的完成，羊水干細胞在小鼠體內(nèi)逐漸消失。修復(fù)后期，羊水干細胞可通過微環(huán)境，募集小鼠自身的干細胞參與修復(fù)。其通過微環(huán)境加快小鼠背部創(chuàng)面的愈合可能是通過B7H4的介導(dǎo)作用。下調(diào) B7

21、H4在羊水干細胞的表達，可介導(dǎo)創(chuàng)面修復(fù)減緩，損傷微環(huán)境中 T淋巴細胞浸潤數(shù)量增加以及炎癥反應(yīng)加劇。我們的實驗發(fā)現(xiàn)負性B7家族分子-B7H4是介導(dǎo)羊水干細胞免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。羊水干細胞通過表達負性分子B7H4,建立有利于創(chuàng)面修復(fù)的炎癥反應(yīng)微環(huán)境，從而加快創(chuàng)面的愈合。
　　第三部分人羊水干細胞向真皮汗腺細胞分化的研究
　　目的：定向誘導(dǎo)羊水干細胞分化為真皮汗腺樣細胞，并對其生物學(xué)特性及功能進行鑒定，在此基礎(chǔ)上，進一步探討羊水干

22、細胞來源汗腺細胞對小鼠汗腺損傷修復(fù)。
　　方法：用傳統(tǒng)方法將羊水干細胞培養(yǎng)后,Real-time PCR檢測不同株羊水干細胞在汗腺相關(guān)基因的表達，分析其向汗腺細胞分化的潛能。取第三代的羊水干細胞，以2×104個/皿的密度接種于6cm細胞培養(yǎng)皿中，收集培養(yǎng)過人汗腺細胞的條件培養(yǎng)基，用0.22μm的濾器過濾，收集到的培養(yǎng)基為CM及添加shh的汗腺細胞培養(yǎng)基SGM為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，兩者比例為1：1，每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細胞生長至匯

23、合率為70%-80%時，對細胞消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化細胞的形態(tài)變化，分別在7天，14天，21天，28天時對誘導(dǎo)的羊水干細胞進行檢測。Real-time PCR、免疫熒光染色、分別在基因、蛋白水平檢測誘導(dǎo)后細胞的生物學(xué)特征；流式細胞術(shù)檢測羊水干細胞的分化率；透射電鏡技術(shù)觀察細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；三維氣液組織培養(yǎng)方法及H&E染色檢測分化后的羊水干細胞形成汗腺樣結(jié)構(gòu)的能力，免疫熒光染色分析誘導(dǎo)分化的羊水干細胞形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)在汗腺相

24、關(guān)標志的表達。在裸鼠肩部構(gòu)建汗腺損傷模型，將經(jīng)過生物學(xué)功能鑒定的羊水干細胞來源的汗腺細胞注射入損傷部位，注射入的細胞量為2X105。將PBS注射組，同體對側(cè)不做任何處理設(shè)為空白對照組。
　　結(jié)果：(1)羊水干細胞在汗腺相關(guān)基因K18,CD24及K19有比較高的表達，弱表達EDA，EDAR，K8,但不表達CEA；(2)羊水干細胞誘導(dǎo)分化獲得的汗腺細胞形成不同直徑的緊密排列的多層的扁平細胞，呈“鵝卵石”樣，在基因和蛋白水平均表達CEA

25、，且EDA,EDAR及K8的表達也有顯著提高，流式檢測其分化率約為30%以上；(3)透射電鏡結(jié)果顯示，羊水干細胞分化而來的汗腺細胞具有羊水干細胞不具有的特殊細胞器：微絨毛，乙酰膽堿實驗證明該汗腺的分泌功能；(4)三維氣液培養(yǎng)及H&E染色結(jié)果顯示羊水干細胞來源的汗腺細胞能夠進一步分化成熟，形成汗腺樣結(jié)構(gòu)，表達汗腺腺體的標志：EDA，EDAR，CEA，K8，K18，NA-K-ATP及SMA;(5)汗腺肩部損傷部位能夠形成汗腺腺體樣結(jié)構(gòu)，表達

26、K8,CEA等標志。
　　結(jié)論：羊水干細胞具有向汗腺細胞的分化潛能。體外誘導(dǎo)羊水干細胞獲得的汗腺細胞在基因和蛋白水平表達汗腺細胞標志 EDA,EDAR,K8,CEA，其分化率約為30%，分化獲得的汗腺細胞具有汗腺的典型特征：微絨毛，并且能進一步分化形成汗腺樣結(jié)構(gòu)，表達汗腺腺體的標志，能夠在體外修復(fù)損傷汗腺，形成汗腺腺體結(jié)構(gòu)。
　　綜上所述，本研究建立的羊水干細胞體外培養(yǎng)和擴增體系，并檢測了其生物學(xué)特征，在此基礎(chǔ)上，體外分化形

27、成表皮角質(zhì)細胞不僅在細胞水平，更在分子、超微結(jié)構(gòu)上證實了分化而來的角質(zhì)細胞不僅具有正常角質(zhì)細胞的形態(tài)，而且能進一步成熟形成復(fù)層上皮,同時也通過體內(nèi)實驗證實羊水干細胞表達的負性B7H4分子介導(dǎo)其免疫調(diào)節(jié)作用，使小鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)效果顯著。并在此基礎(chǔ)上，初步研究了羊水干細胞向真皮層汗腺細胞的分化，證明了羊水干細胞不僅能在體外誘導(dǎo)分化形成汗腺細胞，并且能在體內(nèi)形成汗腺樣結(jié)構(gòu)，這為進一步探討羊水干細胞移植治療大面積深度燒傷及其他免疫系統(tǒng)疾病的臨床