干細(xì)胞在急性腎小管壞死修復(fù)中的作用.pdf

1、研究背景及目的: 急性腎功能衰竭(Acute Rrenal Failure，ARF)是臨床上常見的急危重病，而急性腎小管壞死(Acute Tubular Necrosis，ATN)是急性腎衰最常見的類型，約占75％～80％。由于對(duì)損傷腎小管修復(fù)過程了解甚少，目前尚缺乏行之有效的治療方法，其死亡率達(dá)50-80％。近年由于對(duì)于細(xì)胞研究的逐漸深入，有證據(jù)表明在成年動(dòng)物和人類腎組織內(nèi)存在有腎干細(xì)胞，并可能在ATN的修復(fù)過程中起著重要作用

2、。因此本實(shí)驗(yàn)擬利用ATN動(dòng)物模型，觀察干細(xì)胞標(biāo)記物BrdU、Nestin和CD133在大鼠缺血再灌注損傷后腎臟內(nèi)的表達(dá)情況，以進(jìn)一步了解干細(xì)胞在ATN修復(fù)過程中的作用。 研究方法: 1.大鼠腎臟組織的收獲 體重220g左右的6周齡雌性SD大鼠左腎動(dòng)脈夾閉60rain后再灌注(假手術(shù)對(duì)照組不夾閉左腎動(dòng)脈)，制作SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型(FR)，經(jīng)BrdU標(biāo)記，術(shù)后第1、3、5、7、14、21、28、56天收集

3、血樣和腎臟標(biāo)本。 2.Scr、BUN測(cè)定經(jīng)心臟穿刺留取的血液2ml，靜置30min，3000r/min離心30min后收集血清，Beckman自動(dòng)生化儀測(cè)定BUN,Scr值。 3.石蠟包埋及石蠟切片 腎臟組織經(jīng)過10％福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋。石蠟切片成4μm組織切片，烤片60℃ 2h。 4.HE染色 石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素-伊紅染色，再梯度酒精及二甲苯脫水，封片

4、，鏡檢。 5.免疫組化EnVision法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。依次消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原修復(fù)，組織背景封閉，滴加特異性抗體，酶標(biāo)記用ChemMaTMEnVision+/HRP作用切片，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明后封片，鏡檢。 6.免疫熒光雙標(biāo)法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水?？乖迯?fù)，組織背景封閉，滴加特異性抗體1。IgG-FITC標(biāo)記的熒光二抗作用。切片預(yù)處理。胃蛋白酶消化，2N HCl孵

5、育。組織背景封閉，滴加特異性抗抗體2。IgG-TR標(biāo)記熒光二抗作用，最后用DAPI孵育15min。撈片，陰干，甘油封片。 結(jié)果: I/R組和假手術(shù)對(duì)照組Scr和BUN水平無大變化。I/R組術(shù)后3天出現(xiàn)明顯的近端腎小管上皮細(xì)胞廣泛性壞死和少量凋亡；術(shù)后3天腎組織BrdU的表達(dá)最明顯；并可見部分細(xì)胞Brdu和Nestin、Brdu和CD133共同表達(dá)。以后這些特異性標(biāo)志物表達(dá)有所下降但仍高于假手術(shù)對(duì)照組。 結(jié)論: