自體骨髓源性成體干細(xì)胞移植治療急性腎小管壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 建立兔腎臟缺血再灌注(ischemic-reperfusion，I/R)損傷誘發(fā)急性腎小管壞死動(dòng)物模型，采用經(jīng)腎動(dòng)脈灌注途徑向腎臟內(nèi)移植自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞，觀察骨髓源性干細(xì)胞對(duì)急性腎小管壞死腎功能的影響和骨髓源性干細(xì)胞是否具有向損傷腎組織歸巢的能力及其在腎臟組織中的分布，初步探討骨髓源性干細(xì)胞移植促進(jìn)急性腎小管壞死修復(fù)的作用和可能機(jī)制，以及細(xì)胞移植的有效途徑，為骨髓源性干細(xì)胞移植治療急性腎小管壞死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：健康日本大耳白兔42只，隨機(jī)分成2組，每組21只。①移植組，I/R損傷+自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞腎動(dòng)脈灌注；②對(duì)照組，I/R損傷+等量生理鹽水腎動(dòng)脈灌注。 2.骨髓單個(gè)核細(xì)胞的制備及細(xì)胞標(biāo)記：兔髂前上嵴局部注射普魯卡因麻醉后抽取10ml骨髓液，通過(guò)密度梯度離心法分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將其移入含10mlDMEM/F12完全培養(yǎng)基的25cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/ml，加入

3、5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)，使其終濃度為20μmol/L，對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，置入體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。 3.腎臟缺血再灌注損傷模型制備：以3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)兔耳緣靜脈注射麻醉，采用腹部正中切開(kāi)術(shù)分別暴露右腎和左腎，結(jié)扎右腎動(dòng)脈、靜脈和輸尿管后切除右腎；鈍性分離左腎動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈105min后取出動(dòng)

4、脈夾，使左腎動(dòng)脈血流恢復(fù)，造成腎缺血再灌注損傷。通過(guò)腎功能相關(guān)的血生化指標(biāo)測(cè)定及病理組織學(xué)觀察確定急性腎衰模型建立成功。 4.骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植：在兔腎臟缺血再灌注損傷模型制備完成并明確左腎動(dòng)脈血流恢復(fù)后于右腹股溝區(qū)切開(kāi)皮膚，鈍性分離右股動(dòng)脈，從右股動(dòng)脈插入導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈進(jìn)入左腎動(dòng)脈約0.5cm處，在腹主動(dòng)脈與左腎動(dòng)脈分支處下方0.5cm處以一手指按壓腹主動(dòng)脈以暫時(shí)阻斷腹主動(dòng)脈血流，移植組經(jīng)導(dǎo)管緩慢勻速注射5ml骨髓細(xì)胞懸液，細(xì)

5、胞數(shù)量為1.5×107個(gè)，注射完畢后退出導(dǎo)管，縫合血管壁和皮膚；對(duì)照組用同樣方法注射等量生理鹽水。 5.動(dòng)物一般狀況監(jiān)測(cè)：實(shí)驗(yàn)期間觀察兔飲食、活動(dòng)、皮毛色澤、體重等變化。 6.血生化指標(biāo)監(jiān)測(cè)：I/R損傷前(T0)和I/R損傷后第1、3、5、7、14、21、28天(T1、T3、T5、T7、T14、T21、T28)于兔耳緣靜脈采血1ml，測(cè)血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)。

6、 7.腎組織病理組織學(xué)觀察及BrdU免疫組化分析：取I/R損傷前和I/R損傷后第1、3、5、7、14、21、28天的左側(cè)腎組織，進(jìn)行病理組織切片，分別行HE、PAS、PASM染色和腎組織BrdU免疫組化檢測(cè)。 結(jié)果： 1.一般情況：兩組兔I/R損傷后飲水量與I/R損傷前相比均明顯增多，進(jìn)食減少，第7天后進(jìn)水、進(jìn)食均逐漸增多并恢復(fù)正常；兩組I/R損傷后均出現(xiàn)困盹、萎靡、活力下降，3天后移植組精神狀態(tài)、活動(dòng)能力明顯改善；兩組

7、I/R損傷后體毛逐漸干枯，失去光澤，部分出現(xiàn)脫毛，移植組2周后，體毛逐漸開(kāi)始光滑潤(rùn)澤；兩組I/R損傷后體重均下降，七天后體重均逐漸增加，至第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組體重均重于實(shí)驗(yàn)前，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組于I/R損傷后第1天、第3天各死亡1只，解剖見(jiàn)胸腔內(nèi)大量胸水，可能與嚴(yán)重的腎功能衰竭有關(guān)；移植組于I/R損傷后第7天死亡1只，解剖見(jiàn)腸粘連，腹腔大量膿液，可能與術(shù)后感染有關(guān)。 2.BrdU標(biāo)記細(xì)胞

8、的濃度和時(shí)間：非標(biāo)記組未見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞存在；標(biāo)記24h、48h、72h三組均見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，BrdU陽(yáng)性反應(yīng)物位于細(xì)胞核，呈棕色、顆粒狀或彌散分布。相同濃度隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)，標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目逐漸增多；相同時(shí)間隨著濃度的升高標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。以20μmol/L為終濃度培養(yǎng)72h，陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記率達(dá)到最佳，為(97±2.6)％，增加BrdU標(biāo)記濃度細(xì)胞標(biāo)記率并未見(jiàn)升高。因此，本實(shí)驗(yàn)選用標(biāo)記72小時(shí)、終濃度為20μmol/L作為最佳標(biāo)

9、記時(shí)間和濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖與非標(biāo)記組相比未見(jiàn)異常。 3.血生化指標(biāo)：I/R損傷前，兩組兔之間SCr、BUN差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。I/R損傷后第1天和第3天SCr、BUN均逐漸達(dá)到最高水平，但兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，以后SCr、BUN逐漸下降，但移植組下降速度明顯快于對(duì)照組，第7天后移植組SCr及BUN水平逐漸低于對(duì)照組，到實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束時(shí)的第28天，對(duì)照組SCr和BU

10、N分別為(135.6±32.5)μmol/L和(10.9±2.5)mmol/L，移植組SCr和BUN分別為(90.1±11.1)μmol/L和(8.0±1.5)mmol/L，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)；電解質(zhì)無(wú)明顯變化。 4.腎組織病理組織學(xué)觀察結(jié)果：普通病理觀察，I/R損傷后腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死甚至脫落，部分壞死腎小管可見(jiàn)壞死脫落細(xì)胞填塞，病變于腎皮質(zhì)或皮髓交界處明顯，而腎小球未見(jiàn)明顯異常。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，壞死腎小管

11、逐漸修復(fù)，但移植組修復(fù)程度明顯好于對(duì)照組。 5.腎組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果：腎組織BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組BrdU染色陰性，而移植組于細(xì)胞移植后第5、7天逐漸顯示腎小管BrdU陽(yáng)性染色并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，并隨著時(shí)間的推移，陽(yáng)性染色逐漸增強(qiáng)。陽(yáng)性染色主要分布在腎組織外髓質(zhì)及皮髓交界處，部分腎小球內(nèi)亦顯陽(yáng)性染色。 結(jié)論： 1.骨髓源性干細(xì)胞移植能在一定程度上加速急性腎小管壞死后腎功能的修復(fù)。 2.骨髓源