骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后自體移植的臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目前對(duì)于晚期肝病(如肝硬化等)的最佳治療方法是肝臟移植,但是由于缺少供體以及排斥反應(yīng),使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。相比之下,干細(xì)胞移植不僅來源廣泛,創(chuàng)傷性小,而且干細(xì)胞的免疫源性低,其排斥反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝臟移植。干細(xì)胞移植不但可以用于晚期肝病,也可以用于重癥肝病的治療,前景廣闊。骨髓細(xì)胞可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群,被稱之為骨髓源性肝干細(xì)胞(bone marrow derived liver stem cells BMDLSC),為肝

2、臟疾病治療提供了新思路和新手段。盡管肝干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記至今沒有發(fā)現(xiàn),但Lagasse在酪氨酸小鼠研究中發(fā)現(xiàn)c-kit+Sca+Lin-細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的能力比較強(qiáng)[1],而后唐等在放射性小鼠肝損傷修復(fù)更是進(jìn)一步指出c-kit+Lin-(CD117)是一群富含BMDLSC的骨髓干細(xì)胞群[2],本小組前期研究已經(jīng)證實(shí),骨髓中CD117陽性細(xì)胞和CD184陽性細(xì)胞都具有較強(qiáng)的肝干細(xì)胞潛能[3-5]。與其它類型的骨髓干細(xì)胞類似,c-kit

3、+Lin-細(xì)胞的數(shù)量有限,難以滿足未來應(yīng)用的需要。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用非連續(xù)Percoll密度梯度離心對(duì)人自體骨髓進(jìn)行分離,分離后的各界面層的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測CD117陽性細(xì)胞和CD184陽性細(xì)胞的比例,確定比例最高的細(xì)胞群后,從新鮮骨髓中獲取富含CD117陽性細(xì)胞和CD184陽性細(xì)胞的組分用于后實(shí)驗(yàn)。然后將細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增0天、7天、14天,擴(kuò)增方案采用含10％自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中和無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系

4、中加入不同濃度的促肝細(xì)胞生長素(HGPF)、促血小板生長素(TPO)和白細(xì)胞介素3(IL-3),分別培養(yǎng)摸索最佳培養(yǎng)基體系,經(jīng)最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定擴(kuò)增細(xì)胞中CD117陽性細(xì)胞和CD184陽性細(xì)胞的數(shù)量變化,用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測c-Met RNA表達(dá)的變化。總結(jié)出人自體骨髓來源肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后自體移植的技術(shù)方案,為將來臨床上進(jìn)行骨髓來源肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后自體移植治療肝臟疾病奠定基礎(chǔ)。
　　 [材料和方法]<

5、br>　　 1、密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)提取骨髓來源肝干細(xì)胞
　　 1.1 Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離骨髓細(xì)胞群
　　 從骨科手術(shù)回收成人骨髓2～5ml,使用percoll作為分離液,分成60％(1.077g/ml)、50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)、30％(1.043 g/ml)四個(gè)密度費(fèi)聯(lián)系梯度,分離出4個(gè)有核細(xì)胞組分。
　　 1.2流式細(xì)胞儀檢測各個(gè)細(xì)胞組分中C

6、D117陽性細(xì)胞核CD184陽性細(xì)胞比例
　　 細(xì)胞計(jì)數(shù)后,取1×106個(gè)細(xì)胞置于1.5ml EP管中,離心調(diào)整為100μl體積,避光環(huán)境下,各管分別以PE標(biāo)記抗人CD117直接抗體和APC標(biāo)記抗人CD184直接抗體,細(xì)胞重懸至300μl上機(jī)檢測,分別記錄CD117陽性細(xì)胞核CD184陽性細(xì)胞比例。
　　 2、人骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增方案的探討
　　 2.1密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分離富含CD117+細(xì)胞群<

7、br>　　 采集人體骨髓10～20ml,使用percoll作為分離液,分成50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)兩種濃度,過濾除菌后,由下至上按密度遞減置于離心管中,將預(yù)處理后的骨髓細(xì)胞懸液緩慢加至分層液上,400g離心力,離心25～30分鐘,可見各密度層間細(xì)胞層,留取CD117+細(xì)胞比例最高(Percoll濃度為50％與40％之間的細(xì)胞層)的細(xì)胞層為目的細(xì)胞群。
　　 2.2體外擴(kuò)增富含CD117+人

8、自體骨髓來源肝干細(xì)胞
　　 2.2.1確定細(xì)胞培養(yǎng)密度
　　 骨髓細(xì)胞懸液,經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50％與40％之間層的細(xì)胞群,分別調(diào)整細(xì)胞濃度至6.25×105/ml、1.25×106/ml、2.50×106/ml、5.00×106/ml、1.00×107/ml、2.00×107/ml五組細(xì)胞濃度,于24孔板上培養(yǎng)14天,,培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(高糖,含10％自體血清,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲

9、肟),分別細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。
　　 2.2.2確定細(xì)胞擴(kuò)增最佳體系
　　 培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(高糖,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲肟),分別添加注射用促肝細(xì)胞生長素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml),注射用促血小板生長素(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml),白細(xì)胞介素3(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml),自體血清(10％、0％)

10、,共計(jì)128種組合。骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50％與40％之間層的細(xì)胞群,于24孔板上,隨機(jī)分成138份按確定的最佳細(xì)胞密度(細(xì)胞濃度為2.50×106/ml)分別加入到上述各培養(yǎng)基組合中,共計(jì)128孔,另外10份加入到隨機(jī)培養(yǎng)基組合中,作為計(jì)數(shù)對(duì)照孔,培養(yǎng)14天,根據(jù)生長情況傳代。分別記錄7天和14天細(xì)胞數(shù)量。
　　 2.3最佳體系擴(kuò)增后檢測
　　 配置最佳培養(yǎng)體系:DMEM培養(yǎng)基(含10

11、％自體血清,40μg/mL注射用促肝細(xì)胞生長素,50ng/ml注射用TPO,10ng/ml白細(xì)胞介素3,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲肟)。
　　 2.3.1最佳擴(kuò)增體系培養(yǎng)前后細(xì)胞表面CD117、CD184標(biāo)記的變化 采集8例肝硬化患者骨髓,經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度50％N40％之間層的細(xì)胞群,于37℃、5％CO2孵育,每3～4天更換1/3量培養(yǎng)基,根據(jù)生長情況傳代,分別于培養(yǎng)前,培養(yǎng)第7天、第14天留取樣本,在

12、100ul環(huán)境中按1×106細(xì)胞加入20ul PE標(biāo)記抗人CD117直接抗體以及20ul APC標(biāo)記抗人CD184直接抗體孵育20分鐘,600g離心3分鐘,去上清,用1×PBS吹打勻細(xì)胞,600g離心力離心3分鐘,清洗3次,分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,觀察和計(jì)算最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)7天、14天后,細(xì)胞組分中CD117陽性細(xì)胞、CD184陽性細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。
　　 3、人骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后c-Met RNA表達(dá)的變化
　　

13、 3.1分組
　　 擴(kuò)增0天(陰性對(duì)照)、擴(kuò)增7天、擴(kuò)增14天以及肝組織細(xì)胞(陽性對(duì)照)
　　 3.2引物設(shè)計(jì)合成
　　 GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。設(shè)計(jì)引物所用軟件名稱:Primer express 2.0軟件,序列如下:Sequence Name:H-HGFR(擴(kuò)增片段長度101bp)Forward Primer:5'-GCT GGA ACA CCC AGA TTG T

14、TT C-3’Reverse Primer:5’-CGA CAA CTA GAG CCA TGT TGA TG-3,Sequence Name:H-β-actin(擴(kuò)增片段長度106bp)Forward Primer:5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’Reverse Primer:5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’
　　 細(xì)胞總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反應(yīng)條件:37

15、℃ 1h,然后95℃ 3分鐘),熒光定量PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件為:93℃ 3分鐘,然后93℃ 30秒,55℃ 45秒,72℃45秒,共40循環(huán))。
　　 3.3計(jì)算各細(xì)胞群HGFR/c-Met mRNA的表達(dá)水平與內(nèi)參基因H-β-actin比值
　　 反應(yīng)結(jié)束后,由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。結(jié)果拷貝數(shù),用B表示,即B=拷貝數(shù)/μl cDNA?？紤]到各個(gè)樣本總RNA濃度的差異,最終計(jì)算結(jié)果按下列公式換算:A=B1(目的基因)÷

16、B2(內(nèi)參基因),A則為HGFR/c-Met mRNA的表達(dá)水平與內(nèi)參基因H-β-actin比值。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析
　　 [結(jié)論]
　　 1)人骨髓有核細(xì)胞經(jīng)Percoll密度梯度離心后,位于40％與50％Percoll層之間的細(xì)胞群CD117陽性和CD184陽性的細(xì)胞比例最高。
　　 2)含10％自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加入HGPF 40μg/ml、TPO 50ng/ml、IL-310 n

17、g/ml是體外擴(kuò)增骨髓源性肝干細(xì)胞的可行方案:按以上培養(yǎng)方案,7天時(shí)CD117陽性細(xì)胞和CD184陽性細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別達(dá)到6.55倍和6.20倍,14天時(shí)CD184陽性細(xì)胞和CD117陽性細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為11.62倍和20.57倍。臨床應(yīng)用本方案擴(kuò)增骨髓源性肝干細(xì)胞可以顯著減少抽取骨髓的需要量。
　　 3)BMDLSC細(xì)胞經(jīng)上述擴(kuò)增方案擴(kuò)增0天、7天、14天后,細(xì)胞的c-Met RNA表達(dá)水平表現(xiàn)為先上升后下降,分別為0.0