經肝動脈自體骨髓干細胞移植治療急、慢性肝病的實驗研究.pdf

1、肝硬化是各種慢性肝病的終末期表現，目前尚無特別有效的治療方法，對其治療方法的研究一直處于不斷的探索之中。肝移植因其能夠較好地改善肝功能、延長肝硬化患者的生存期，已成為較理想的治療選擇，然而由于其治療費用昂貴、供肝數量有限以及倫理道德等方面的問題，又限制了其在臨床上的廣泛應用，因此，探索和尋找一種經濟易行、又無供求限制的新方法，已成為目前研究的熱點。近年來，隨著對干細胞研究的不斷深入，特別是骨髓干細胞具有的多向分化潛能及超強的可塑性逐漸受

2、到重視，部分領域在臨床已得到初步應用，如心肌缺血、糖尿病，肝病等?；A研究表明骨髓干細胞在體外誘導培養(yǎng)時可轉化為功能成熟的肝細胞，在活體實驗中骨髓干細胞可在肝損傷和肝纖維化的環(huán)境內存留、生長和轉化，改善肝功能。在目前肝病的干細胞治療實驗研究中大多采用大鼠四氯化碳(CCL4)誘導的肝硬化模型，其采用的異體干細胞移植與局部注射移植方法離臨床實用有很大差別，而大動物的肝硬化模型尚不成熟。目前骨髓干細胞移植在肝臟疾病治療的實驗研究中，已經證明骨

3、髓干細胞對肝損傷和重癥肝病較好的治療效果，但對肝硬化似乎不很理想，因此探索增強干細胞移植對肝硬化治療效果的方法非常必要。本研究從中等動物兔肝硬化模型和肝損傷模型中，利用自體骨髓干細胞作為種子細胞，采用臨床最方便、實用的經肝動脈途徑的移植方法進行實驗研究，通過對肝功能的跟蹤檢測和動物肝臟組織病理對照觀察，來評價骨髓干細胞移植對肝損傷和肝硬化治療的安全性及有效性。并用促肝細胞生長素作為干擾因素探索提高骨髓干細胞對肝硬化治療效果的方法。

4、 實驗目的： 探索應用四氯化碳制作兔急性肝損傷及肝硬化模型的方法，評價該方法的可行性和制模成功率。 材料與方法： 雄性新西蘭大白兔70只，分成3組：正常對照組(10只)、急性肝損傷模型組(15只)、肝硬化組(45只)，急性肝損傷組每只每日皮下注射50％ CCL4橄欖油溶液0.8ml/kg，連續(xù)注射4天，第7天檢測肝功能及肝臟病理。肝硬化組給予皮下注射注射50％CCL4橄欖油溶液0.2 ml/kg，每周2次，12

5、周后檢測肝功能及肝臟病理。對照組分兩組分別按相同劑量和時間給予皮下注射橄欖油溶液。 實驗結果： 1.兔急性肝損傷模型組：在四氯化碳注射4天后，化驗肝功能明顯改變，肝酶活性顯著升高，谷丙轉氨酶由35.83±8.04u/l上升至331.00±29.15u/l，總膽紅素由6.41±0.52 umol/l上升至11.64±0.58umol/l。病理可見大面積肝細胞腫脹、壞死、并可見脂肪變性、肝組織結構紊亂，炎性細胞浸潤明顯。模型

6、制備成功率為100％。 2.肝硬化模型組：在四氯化碳注射12周后，肝功能檢查部分指標變化明顯，白蛋白由40.28±2.30g/l減少至27.46±1.76g/l。凝血酶原活動度由64.32％降低至28.28％。HE病理染色及Masson纖維染色顯示肝組織出現明顯的纖維增生和較典型的假小葉，肝細胞可見濁腫，并見部分炎性細胞浸潤。模型制備成功率為55％。 實驗結論： 應用皮下注射CCL4的方法可成功地建立兔急性肝損傷

7、和肝硬化動物模型。但肝硬化模型制作時間長，動物死亡率高。 實驗目的： 評價自體骨髓干細胞經肝動脈移植對兔急性肝損傷模型的治療作用，并觀察促肝細胞生長素在干細胞移植治療中的作用。 材料和方法： 新西蘭雄性大白兔15只，每日皮下注射50％CCL4橄欖油溶液0.8ml/kg連續(xù)4天制作急性肝損傷模型。模型形成后將動物隨機分為2個實驗組和對照組(各5只)，3天后實驗組經兔脛骨抽取骨髓約5ml，采用密度梯度離心法分

8、離骨髓單個核細胞(干細胞)，制成5ml細胞懸液。動物麻醉后在透視下股動脈穿刺插管將分離的骨髓干細胞經肝動脈注入肝臟。實驗2組在干細胞移植前后隔日靜脈注射促肝細胞生長素(pHGF)2.0mg/kg，共持續(xù)20天。干細胞移植后2周、4周、8周分別抽血進行肝功能檢測，8周后取兔肝臟組織標本進行病理學觀察。 實驗結果： 連續(xù)注射CCL44天后，血清肝酶及總膽紅素明顯上升，病理顯示肝組織結構紊亂，大量肝細胞壞死、水腫和脂肪變性，匯

9、管區(qū)及周圍有大量炎性細胞浸潤。骨髓干細胞肝動脈移植后肝功能逐漸改善，至移植后8周，血清AST、ALT活性和TBIL含量顯著低于對照組(P<0.05)，而TP、ALB含量明顯高于對照組(P<0.05)，而且實驗2組上述指標改變更明顯，與對照組和實驗1組之間均有明顯差異。 病理組織學觀察實驗組肝臟組織結構清楚，細胞排列規(guī)則，二組之間無明顯差別，而對照組有纖維組織增生和肝細胞變性。免疫組化染色發(fā)現肝組織內散在分布有不同數量的CD34+

10、肝樣細胞，并且這些肝細胞在各組數量差異較大，對照組每高倍鏡視野約1～2個，干細胞移植組3～5個，移植+pHGF組6～8個。 實驗結論： 1.自體骨髓干細胞經肝動脈移植對兔急性肝損傷模型有明顯治療作用，可改善急性肝損傷動物的肝功能，并促進肝組織結構重建。 2.促肝細胞生長素(pHGF)能保護肝細胞，促進干細胞在肝臟內的歸巢和分化，加速肝組織的修復和肝功能的改善。 實驗目的： 評價自體骨髓干細胞經肝動脈

11、移植對兔肝硬化模型的治療作用，并比較促肝細胞生長素在干細胞移植治療中的協(xié)同作用，為干細胞移植的臨床應用提供實驗研究基礎。 實驗方法： 用皮下注射四氯化碳(CC14)橄欖油溶液的方法復制兔肝硬化模型，模型動物分為實驗1組、實驗2組和對照組。在無菌條件下從兔脛骨上端抽取骨髓4～5ml，采用密度梯度離心法分離純化骨髓干細胞，然后在透視下將分離的骨髓干細胞經肝動脈移植于肝臟。術后實驗2組隔日靜脈內注射pHGF2mg/kg共20天

12、，然后在移植后4、8、12周分別檢測肝功能，12周行肝臟病理學檢查。實驗數據資料采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，P<0.05為差異有顯著性。 實驗結果： 在干細胞移植12周后，動物谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)逐漸降低；總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)逐漸升高，部分凝血酶原時間(APTT)逐漸上升，但這些改變與對照組相比無差異顯著性(P>0.05)。而移植+pHGF組肝功能指標改變較移植組迅速，與對照組相比

13、有明顯差異(P<0.05)。 病理學檢查顯示干細胞移植組肝細胞形態(tài)較規(guī)整，無明顯水腫和變性，假小葉結構仍存在，但肝組織纖維化程度較對照組明顯，形態(tài)上有較明顯的差異。免疫組化染色發(fā)現肝組織內散在分布有CD34+肝樣細胞，并且這些肝細胞在各組數量差異較大，對照組每高倍鏡視野約2～3個，干細胞移植組3～6個，移植+pHGF組6～9個。 實驗結論： 1、自體骨髓干細胞移植對肝硬化有一定的治療作用。 2、促肝細胞生