自體骨髓干細(xì)胞移植治療兔糖尿病下肢缺血性疾病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：隨著人類生活水平的提高和老齡社會(huì)的到來，糖尿病的發(fā)病率逐年增高，其并發(fā)癥糖尿病足和截肢所帶來的醫(yī)療耗費(fèi)巨大，給社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)治療主要是內(nèi)科的藥物治療、外科的手術(shù)治療及介入治療進(jìn)行血流重建，療效均不夠理想。干細(xì)胞移植這項(xiàng)新技術(shù)在此領(lǐng)域的臨床應(yīng)用得到越來越多的關(guān)注，給糖尿病足的治愈提供了新方法。 第一部分糖尿病動(dòng)物模型的制作 目的：本實(shí)驗(yàn)選用四氧嘧啶(ALX)誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型，探索一種安全、穩(wěn)定、動(dòng)

2、物低死亡率的糖尿病模型建立方法。 方法：健康新西蘭兔20只，隨機(jī)分為A、B兩組，每組10只。兩組給藥前均禁食12小時(shí)，A組為一次給藥法組，即按150mg/kg經(jīng)耳緣靜脈快速注射新鮮配置的5％ALX；B組為兩次給藥法組，第1次給藥，按80mg/kg經(jīng)耳緣靜脈快速注射新鮮配置的5％ALX，24小時(shí)后第2次給藥，按120mg/kg再次經(jīng)耳緣靜脈快速注射新鮮配置的5％ALX。14天后測空腹血糖值，以空腹血糖>16mmol/L作為造模成功

3、的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：A組48小時(shí)內(nèi)死亡4只，第3天死亡2只，第5天死亡1只，死亡率70％，1只血糖短暫升高，兩周后恢復(fù)正常，2只達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，成模率20％；B組48小時(shí)內(nèi)死亡1只，死亡率10％，1只血糖短暫升高，兩周后恢復(fù)正常，8只達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，成模率80％。 結(jié)論： 1.ALX連續(xù)2次小劑量給藥法優(yōu)于1次性高劑量給藥，降低了死亡率，提高了成模率。 2.應(yīng)用ALX制備糖尿病模型，是一種經(jīng)濟(jì)、安全、可靠的方法

4、。 第二部分糖尿病兔骨髓干細(xì)胞動(dòng)員及影響 目的：通過監(jiān)測健康兔、糖尿病兔及未成模兔三組應(yīng)用相同劑量粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員后的外周血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)及骨髓粒-單核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)培養(yǎng)計(jì)數(shù)，對比三組的動(dòng)員效果有無差別，以探討糖尿病對骨髓干細(xì)胞動(dòng)員有無影響。通過比較糖尿病動(dòng)物模型在動(dòng)員前后血紅蛋白、血小板、空腹血糖、血液流變學(xué)等各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，探討骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對糖尿病的影響。

5、 方法：健康新西蘭兔，隨機(jī)分為A、B、C三組。A組為健康兔10 只，B組為糖尿病兔10只，C組為未成模兔5只(ALX劑量同B組)。A、B、C三組在動(dòng)員前分別測外周血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，然后三組分別皮下注射10ug他G-CSF進(jìn)行動(dòng)員，每天1次，連續(xù)5天。在應(yīng)用G-CSF動(dòng)員期間，每天檢測三組外周血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，觀察各組動(dòng)員效果，動(dòng)員第6天檢測三組外周血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，同時(shí)三組均抽取骨髓液3ml，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，檢測骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，并

6、進(jìn)行CFU-GM培養(yǎng)。B組(糖尿病組)中的10只糖尿病兔在動(dòng)員前及動(dòng)員第6天分別監(jiān)測血紅蛋白、血小板、空腹血糖、血液流變學(xué)變化情況。 結(jié)果： 1.動(dòng)員前三組外周血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)無差別。動(dòng)員后三組外周血單個(gè)核細(xì)胞均較前明顯升高，計(jì)數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。動(dòng)員后三組骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)比較無差別。 2.CFU-GM培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，三組均在培養(yǎng)的5～6天開始有集落形成，以后數(shù)目逐漸增多，大約12天達(dá)高峰，此后集落不斷增大，總的集落

7、數(shù)不再增加，三組集落培養(yǎng)計(jì)數(shù)無差別。 3.動(dòng)員前后10只糖尿病兔的晨空腹血糖值有一定的下降趨勢，血紅蛋白、血小板均有所升高，但變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。10只糖尿病兔的晨空腹血流變中的血漿粘度及紅細(xì)胞聚集性動(dòng)員前后無明顯變化；全血粘度動(dòng)員后較動(dòng)員前均明顯升高。 結(jié)論： 1.糖尿病對骨髓干細(xì)胞動(dòng)員效果無影響。 2.應(yīng)用G-CSF骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對糖尿病兔的血糖、血紅蛋白、血小板無影響，對血流變有影響，提示臨床應(yīng)予重

8、視并干預(yù)。 第三部分自體骨髓干細(xì)胞移植治療兔糖尿病下肢缺血性疾病 目的：對比骨髓干細(xì)胞移植、皮下注射G-CSF、骨髓干細(xì)胞移植聯(lián)合G-CSF皮下注射三種方法對缺血組織血管新生的作用效果。 方法：健康新西蘭兔40只，以第一部分中介紹的二次給藥法，用ALX誘導(dǎo)成為糖尿病兔后，均結(jié)扎右后肢股動(dòng)脈，建立糖尿病下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，隨機(jī)分成A、B、C、D四組，每組10只。A組：模型建立后，開始皮下注射10ug/kgG-CSF進(jìn)

9、行動(dòng)員，每天1次，連續(xù)5天。B組：如A組方法動(dòng)員，并于動(dòng)員第6天采髓5ml，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞。以右側(cè)股內(nèi)側(cè)正中部位為中心等距離分10個(gè)位點(diǎn)，用1ml注射器依次等量肌肉注射0.1ml骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液(其中5×106個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞/位點(diǎn))，每一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物局部移植的骨髓單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)量為5×107個(gè)。C組：模型建立后，不進(jìn)行動(dòng)員直接采髓10ml，右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌肉注射骨髓單個(gè)核細(xì)胞，注射方法同B組。D組：模型建立后，不進(jìn)行動(dòng)員，右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌肉

10、注射PBS，注射方法同B組。術(shù)后第28天全麻，4組均以右側(cè)股內(nèi)側(cè)正中部位為中心等距離取局部肌肉組織，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作切片，免疫組化染色，檢測各組骨骼肌微血管密度及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.單純用G-CSF治療或單純骨髓干細(xì)胞移植治療，均能使局部缺血組織微血管數(shù)量增加。G-CSF動(dòng)員后再配合骨髓干細(xì)胞移植治療對血管新生的作用更加顯著，局部缺血組織微血管數(shù)量增加更明顯。