GCA-HIF-1α-GCC提高移植骨髓干細(xì)胞存活率及治療缺血性心肌病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，隨著干細(xì)胞工程的興起，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療缺血性心臟病方面?zhèn)涫荜P(guān)注。研究表明，干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞、增加有功能的心肌細(xì)胞數(shù)量，增加心梗區(qū)域血管的密度，改善心功能，干細(xì)胞的存活依賴于所種植的微環(huán)境，移植到缺血心肌的干細(xì)胞存活率極低，嚴(yán)重制約了其療效。實(shí)驗(yàn)證實(shí)低氧誘導(dǎo)因子—1α（hypoxia—inducible factor1α，HIF—1α）能明顯抑制細(xì)胞的凋亡，雖然缺氧心肌能夠產(chǎn)生HIF—1α，但由于降解極快，難以在心肌

2、缺血缺氧中發(fā)揮作用。因此我們運(yùn)用雙定點(diǎn)基因突變的方法重組HIF—1α，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，研究在體內(nèi)外的缺氧條件下，基因突變的HIF—1α能否抑制干細(xì)胞的凋亡，提高治療效果，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討干細(xì)胞自體移植聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染治療缺血性心肌病的機(jī)理。 第一部分 豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)和心梗模型的建立 目的：從豬的骨髓中分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs

3、）以及建立豬的心梗動(dòng)物動(dòng)物模型。 第一節(jié) 豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離、培養(yǎng) 目的：建立豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為細(xì)胞心肌成形術(shù)提供新材料。 方法：豬的骨髓MSCs分離純化后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的原代MSCs10～14d達(dá)到融合，細(xì)胞周期顯示73%的細(xì)胞處于G0/G1期。 結(jié)論：根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCs在體外條件下可生長擴(kuò)增，可用于細(xì)胞心肌成形術(shù)。

4、 第二節(jié) 豬心肌梗死模型的建立 目的：經(jīng)心導(dǎo)管用明膠海綿栓子栓塞豬的冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD），建立心肌梗死的模型。 方法：麻醉后經(jīng)股動(dòng)脈置入心導(dǎo)管至冠狀動(dòng)脈左前降支遠(yuǎn)端用明膠海綿栓塞LAD。8周后行血流動(dòng)力學(xué)、核磁共振、冠狀動(dòng)脈造影及組織學(xué)檢查。 結(jié)果：與對照組相比，心梗（MI）組左室發(fā)展壓（LVDP）降低（P<0.05），±dp/dtmax下降（P<0.05）。與對照組相比，心梗（MI>組左室每搏量（SV

5、）、舒張末期室壁厚度（EDWT）下降（P<0.05）。復(fù)查冠脈造影提示LAD栓塞仍存在。組織學(xué)檢查MI組前室壁、室間隔形成了透壁梗死灶。 結(jié)論：運(yùn)用明膠海綿封堵冠狀動(dòng)脈成功建立豬心肌梗死模型，符合臨床病理生理過程，穩(wěn)定可靠。 第二部分 pcDNA3.1+—GCA—HIF—1α—GCC慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建 目的：構(gòu)建低氧誘導(dǎo)因子—1α（hypoxia inducible factor—1，HIF—1α）真核表達(dá)載體p

6、cDNA3.1+—HIF—1α的突變體pcDNA3.1+—GCA—HIF—1α—GCC，并用慢病毒包裝。 方法：用定點(diǎn)突變的方法將pcDNA3.1+—HIF1α的HIF1α第567位脯氨酸HIF1αPro密碼子CCA突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCA，構(gòu)建成單個(gè)突變HIF1α真核表達(dá)載體pcDNA3.1+HIF1α—567A1α在第一次突變的基礎(chǔ)上仍然用定點(diǎn)突變的方法將pcDNA3.1+—HIF1α—567A1α的第811位天冬

7、酰胺（Asn）密碼子AAT突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCC，構(gòu)建成雙定點(diǎn)突變HIF1α真核表達(dá)載體pcDNA3.1+—GCA—HIF—1α—GCC，重組成HIF1α慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，在293細(xì)胞中包裝成為重組HIF1α慢病毒，并進(jìn)行PCR鑒定及滴度測定，以RT—PCR和Western blot法分別對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)分析。 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實(shí)人雙突變型低氧誘導(dǎo)因子1α真核表達(dá)載體GCA—HIF—1

8、α—GCC構(gòu)建成功，PCR檢測重組慢病毒包裝成功，病毒滴度為2.5×108tu/ml. 結(jié)論：成功構(gòu)建慢病毒包裝重組人雙突變型低氧誘導(dǎo)因子1α真核表達(dá)載體GCA—HIF—1α—GCC，能穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)的蛋白和HIF—1αmRNA。 第三部分 慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的GCA—HIF—1α—GCC基因轉(zhuǎn)染豬骨髓干細(xì)胞及凋亡檢測 目的：觀察慢病毒包裝系統(tǒng)（pPACKHl—Lentivector Packaging Kit）介導(dǎo)的

9、GCA—HIF—1α—GCC基因轉(zhuǎn)染豬MSCs，細(xì)胞內(nèi)GCA—HIF—1α—GCC表達(dá)情況以及對MSCs生長的影響，在低氧的環(huán)境中檢測轉(zhuǎn)GCA—HIF—1α—GCC基因的骨髓干細(xì)胞和原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)慢病毒空載體細(xì)胞的凋亡情況。 方法：取生長良好的第2代MSCs接種，培養(yǎng)至生長匯合70—80%時(shí)，加入慢病毒載體GCA—HIF—1α—GCC，設(shè)定轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）為5，以只含GFP

10、基因的空質(zhì)粒進(jìn)行對照。熒光顯微鏡觀察綠色熒光。提取蛋白后進(jìn)行westernblot蛋白鑒定。用FITC—Annexin V和PI雙染法行流式細(xì)胞儀分析比較MSCs凋亡，轉(zhuǎn)慢病毒空載體的MSCs和轉(zhuǎn)GCA—HIF—1α—GCC的MSCs三種細(xì)胞在1% O237℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的凋亡和死亡情況。Western blot檢測Bax、HO—1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染MSCs48小時(shí)后，可檢測到強(qiáng)熒光出現(xiàn)。Western bl

11、ot免疫印跡技術(shù)表明HIF—1α蛋白表達(dá)產(chǎn)物的分子量與已知分子量相符。原代細(xì)胞在缺氧和乏營養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生大量的凋亡，其凋亡率為61.3%，轉(zhuǎn)空載體的細(xì)胞死亡率達(dá)67.3%，而轉(zhuǎn)GCA—HIF—1α—GCC基因的MSC的凋亡率僅為7.1%。Western blot表明轉(zhuǎn)基因的MSCs，HO—1蛋白表達(dá)增高而Bax表達(dá)降低。 結(jié)論：使用攜帶目的基因GCA—HIF—1α—GCC的慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染豬的骨髓干細(xì)胞可使其穩(wěn)定表達(dá)HIF—1α。轉(zhuǎn)

12、GCA—HIF—1α—GCC的MSCs在體外較MSCs更能耐受缺氧和乏營養(yǎng)所誘發(fā)的凋亡，其原因與HIF—1α穩(wěn)定表達(dá)促使干細(xì)胞分泌HO—1抑制Bax有關(guān)。 第四部分 GCA—HIF—1α—GCC修飾自體骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性心肌病的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討轉(zhuǎn)染GCA—HIF—1α—GCC基因的MSCs自體移植治療缺血性心肌病的療效及機(jī)理，為治療缺血性心肌病提供新的方法。 方法：選用15～20kg梅山小型豬24頭，隨

13、機(jī)分4組：A組：空白組、B組：DMEM組、C組：MSCs組和D組：轉(zhuǎn)基因組，應(yīng)用明膠海綿栓塞LAD建立心梗模型。采用密度梯度離心與貼壁篩選相結(jié)合的方法分離純化、體外擴(kuò)增MSCs，D組MSCs體外轉(zhuǎn)染GCA—HIF—1α—GCC基因。干細(xì)胞（1×107/5 mL）經(jīng)心導(dǎo)管注射到LAD栓塞處遠(yuǎn)端。分別于MSCs注射1周、2周、4周、6周和8周，行Powerlab及MRI檢查，評估心功能和活體內(nèi)干細(xì)胞標(biāo)記情況，采用ELISA法檢測血漿BNP、

14、VEGF在梗死后和干細(xì)胞移植前后的變化；組織學(xué)觀察各組移植細(xì)胞的情況，測算心梗面積，以及Western blot檢測過氧化酶體增殖物激活型受體a（peroxisomeproliferator activated receptorα，PPARα）。 結(jié)果：移植前，磁共振示梗死心臟的左室舒張末徑（EDWT）增加，每搏量（SV）明顯下降，血流動(dòng)力學(xué)LVDP、±dp/dtmax下降明顯。移植后，C、D組的心功能較移植前有改善（P<0.0

15、5），移植的MSCs能防止梗塞區(qū)變薄和擴(kuò)張：與A、B兩組和移植前相比，梗死區(qū)的收縮功能和血流灌注均有所改善（P<0.05），移植組的心梗面積縮?。≒<0.05）；這種心功能的改善在D組更為明（與C組比較，P<0.05）。Western blot檢測PPAR、原位雜交檢測AKT蛋白表達(dá)顯示，與A、B和C組相比，D組PPARα蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）。D組的增加比C組顯著。與A、B兩組相比，C、D組梗死區(qū)的毛細(xì)血管密度明顯增加（P<

16、0.05>，D組的增加比C組顯著，同樣比較，BNP降低明顯（P<0.05），D組的降低比C組顯著。C、D組VEGF的水平在梗死后有所增加，在細(xì)胞移植后一周出現(xiàn)高峰，后逐漸下降。 結(jié)論：MSCs能在宿主心肌組織中存活，通過防止梗死區(qū)變薄、抑制收縮功能異常而改善左室功能。GCA—HIF—1α—GCC轉(zhuǎn)染MSCs可以使移植的干細(xì)胞更能耐受移植早期的缺氧和乏營養(yǎng)的微環(huán)境，減少細(xì)胞的凋亡，增加參與心肌修復(fù)的干細(xì)胞的絕對數(shù)量，從而可更加顯著