骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)后表面MHC抗原表達(dá)的研究.pdf

1、目的:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞后表面MHC抗原表達(dá)類型。探討同種異體MSCs移植的可行性，為其在臨床的應(yīng)用提供依據(jù)。 方法：本試驗以新西蘭兔為試驗動物，抽取其骨髓組織，在體外分離、培養(yǎng)，得到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。形態(tài)觀測：通過倒置顯微鏡動態(tài)觀察體外培養(yǎng)的兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)及生長情況的變化。測標(biāo)志物：取體外培養(yǎng)的第二代細(xì)胞，免疫組化法檢測MSCs CD44表面標(biāo)志物表達(dá)。制生長曲線：取生長良好的第2代細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液

2、，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每皿接種2ml，置于CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，從接種后48小時開始，每日取出三孔，0.25％胰酶消化，計算每個培養(yǎng)皿中的細(xì)胞數(shù)，取均值。連續(xù)觀察8天，以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞：在體外培養(yǎng)的第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞加入含BMP-2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在2周后，檢測骨鈣蛋白的表達(dá)，用來證實MSCs已經(jīng)被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。 骨

3、髓源性成骨細(xì)胞在體外MI-IC抗原表達(dá)：將成骨細(xì)胞消化并接種于兩個6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁生長后，以相間隔2孔為以一組，每組加入鼠抗兔MHCI、MHCII單克隆抗體，4℃下作用12h，PBS洗3次10min，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠Igs，設(shè)立鹽水對照組，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞MHC抗原表達(dá)情況。 結(jié)果：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)后貼壁、集落生長，細(xì)胞呈梭形、多角形，有多個大小不一的突起，胞漿淡藍(lán)色，含有較大的顆粒，核卵圓形，細(xì)胞分裂相多見，連續(xù)

4、傳代培養(yǎng)生長良好。細(xì)胞生長曲線示細(xì)胞生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)2周后骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面CD4抗原表達(dá)陽性。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向誘導(dǎo)后骨鈣蛋白表達(dá)陽性。 骨髓源性成骨細(xì)胞表面MHCII類抗原不表達(dá)、MHCI類抗原表達(dá)。 結(jié)論：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞容易獲取、來源充足、可以大量擴(kuò)增，加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并向成骨細(xì)胞分化，可作為骨組織工程的種子細(xì)胞。BMP-2重組蛋白是良好的成骨誘導(dǎo)劑，低濃度即可引起MSCs分化。骨髓基