外源性透明質(zhì)酸對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化的誘導(dǎo)效應(yīng)研究.pdf

1、第一部分，目的:優(yōu)化獲取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化、鑒定及擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)其生物學(xué)性狀進(jìn)行研究。
　　 方法:取新生新西蘭大耳白兔骨髓5.0ml，采用密度梯度離心法、貼壁篩選法并結(jié)合傳代對(duì)其進(jìn)行純化，觀察細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物的表達(dá)，從而對(duì)其進(jìn)行鑒定。觀察第1、3、5、7代細(xì)胞的增殖情況，并繪制出生長(zhǎng)曲線。
　　 結(jié)果:經(jīng)密度梯度離心、貼壁篩選并結(jié)合細(xì)胞傳代均可得到貼壁細(xì)胞集落，密度梯度離心集落形成率稍高，但貼壁

2、篩選法操作更簡(jiǎn)便。傳代至第3代和第5代細(xì)胞形態(tài)單一，細(xì)胞排列具有典型的漩渦狀結(jié)構(gòu)。第1、3、5代細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛;至第7代細(xì)胞增殖明顯減弱。所分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD34。
　　 結(jié)論:分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，且成份單一，具有多向分化潛能，且無(wú)造血系干細(xì)胞標(biāo)志。經(jīng)體外傳代，增殖能力強(qiáng)，適宜作為種子細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。
　　 第二部分，外源性透明質(zhì)酸對(duì)MSCs增殖及分化情況的影響

3、>　　 目的:通過(guò)研究外源性透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，Mscs)體外增殖及定向分化為軟骨細(xì)胞的影響，探討關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境對(duì)Mscs的作用，為Mscs為基礎(chǔ)的組織工程化軟骨的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:全骨髓法+貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔Mscs，取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入HA誘導(dǎo)液(含0.25mg/mlHA+含10％FBS的HG-DMEM)

4、，以TGF-β3誘導(dǎo)組作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照組加入常規(guī)培養(yǎng)液。分別于誘導(dǎo)后第7、14、21d行甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白聚糖表達(dá)，免疫組化染色及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)果:經(jīng)HA誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖速度減慢，由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切巍E圓形，細(xì)胞外基質(zhì)呈甲苯胺藍(lán)異染性和Ⅱ型膠原免疫組化陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)示Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)陽(yáng)性，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點(diǎn)，但表達(dá)均比陽(yáng)性對(duì)照組弱。
　　 結(jié)論:外源性HA具有誘導(dǎo)兔

5、Mscs向軟骨細(xì)胞分化的能力，但比TGF-β3的誘導(dǎo)能力弱。提示關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境對(duì)Mscs向軟骨細(xì)胞分化有正性促進(jìn)作用，支持HA作為軟骨組織工程基質(zhì)使用。
　　 第三部分，不同濃度透明質(zhì)酸對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響
　　 目的:探討不同濃度透明質(zhì)酸對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向定向分化的影響。
　　 方法:取P3代未誘導(dǎo)的骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，按培養(yǎng)液中添加的透明質(zhì)酸濃度不同分為兩實(shí)驗(yàn)組，A組:低濃度組

6、(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml)，B組:高濃度組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.2mg/ml)。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）及陽(yáng)性對(duì)照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10ng/mlTGF-β3），觀察細(xì)胞形態(tài)，增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線，分別于誘導(dǎo)后第7、14、21d行免疫組化染色及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)果:經(jīng)添加軟骨誘導(dǎo)劑后，干細(xì)胞細(xì)胞增殖速度放緩，形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切?、橢圓形，胞漿Ⅱ型膠原免疫組化陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)示Ⅱ

7、型膠原mRNA表達(dá)陽(yáng)性，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點(diǎn)，半定量分析顯示兩實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原表達(dá)無(wú)差異，但均比陽(yáng)性對(duì)照組弱，空白對(duì)照組無(wú)Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)論:不同濃度外源性HA誘導(dǎo)兔Mscs向軟骨細(xì)胞分化的能力無(wú)差異，且均比TGF-β3的誘導(dǎo)能力弱。提示HA作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，有促進(jìn)Mscs向軟骨細(xì)胞分化的作用，但改變外環(huán)境中透明質(zhì)酸濃度不會(huì)影響Mscs的軟骨分化。自體關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境支持以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損。

8、
　　 第四部分，不同分子量透明質(zhì)酸對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響
　　 目的:探討不同分子量透明質(zhì)酸對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向定向分化的影響。
　　 方法:取P3代未誘導(dǎo)的骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)液中分別添加不同分子量透明質(zhì)酸做誘導(dǎo)劑，分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，A組:低分子量組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml，平均分子量約1000kD)，B組:中分子量組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml，平均分子量約1

9、800kD)，高分子量組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml，平均分子量約2000kD)。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）及陽(yáng)性對(duì)照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10ng/mlTGF-β3），觀察細(xì)胞形態(tài)，增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線，分別于誘導(dǎo)后第7、14、21d行甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白聚糖表達(dá)，另外采用免疫組化染色及RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)果:經(jīng)添加軟骨誘導(dǎo)劑后，干細(xì)胞細(xì)胞增殖速度放緩，形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切?、橢圓形，細(xì)胞外

10、基質(zhì)呈甲苯胺藍(lán)異染性，胞漿Ⅱ型膠原免疫組化陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)示Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)陽(yáng)性，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點(diǎn)，半定量分析顯示實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原表達(dá)與對(duì)照組有差異，但B、C組間Ⅱ型膠原表達(dá)相似，空白對(duì)照組無(wú)Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)論:不同分子量外源性HA誘導(dǎo)兔Mscs向軟骨細(xì)胞分化的能力存在差異，分子量高的HA的誘導(dǎo)能力較低分子量HA的誘導(dǎo)能力強(qiáng)。證明透明質(zhì)酸的分子量與Mscs的軟骨分化有關(guān)聯(lián)性，但均比TGF-β3的誘導(dǎo)能力弱

11、。提高關(guān)節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸分子量對(duì)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程化軟骨修復(fù)軟骨缺損有幫助。
　　 第五部分，外源性透明質(zhì)酸誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究
　　 目的:探討外源性透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)對(duì)全層軟骨缺損修復(fù)的效果，了解體內(nèi)條件下經(jīng)外源性透明質(zhì)酸誘導(dǎo)的干細(xì)胞能否保持軟骨分化表型，促進(jìn)軟骨修復(fù)。
　　 方

12、法:4月齡日本大耳白兔24只，用手搖鉆制成直徑5mm、深4mmm的圓柱形膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。分四組分別植入藻酸鹽凝膠混合的經(jīng)透明質(zhì)酸誘導(dǎo)后兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（組A，n=6），藻酸鹽凝膠混合的未經(jīng)誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（組B，n=6），單純?cè)逅猁}凝膠組（組C，n=6），及缺損處不處理(組D，n=6)。術(shù)后5、8和12周觀察軟骨缺損修復(fù)情況，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。HE染色觀察軟骨細(xì)胞情況，RT-PCR檢測(cè)修復(fù)組織中Ⅱ型膠原mRNA合成情況。

13、　　 結(jié)果:術(shù)后第8周，A組及B組與其他組比較，缺損處軟骨充填較好，與正常軟骨結(jié)合緊密，融合良好，組織學(xué)評(píng)分有差異，但A組與B組間評(píng)分無(wú)差異。至第12周，可見(jiàn)A組及B組關(guān)節(jié)面平滑，結(jié)合緊密，與周圍軟骨結(jié)合良好，移植物界限基本消失。大體評(píng)分A組、B組均優(yōu)于其他組，且A組與B組間差異有顯著性。組織學(xué)觀察顯示，修復(fù)組織A組類似透明軟骨，B組接近纖維軟骨，C組與D組細(xì)胞以纖維組織為主。PCR檢測(cè)僅在A、B兩組中見(jiàn)Ⅱ型膠原mRNA合成，且A組R