骨髓基質干細胞體外誘導分化及移植治療腦外傷患者的臨床觀察.pdf

1、顱腦外傷在神經外科中常見，但其致殘率及致死率占全身各器官損傷之首。目前臨床的治療手段主要是通過神經營養(yǎng)及神經康復理療促進神經元的發(fā)生及突觸的修復連接，但由于人腦已難以自我修復損傷神經元及產生功能性神經元，因而難以達到理想的療效；細胞移植為腦外傷治療提供了一種新的治療方法，即移植細胞后可補充或再生受損神經細胞。由于神經干細胞存在取材困難以及其自身具有向腫瘤細胞分化的潛在的特性，神經干細胞的移植難以應用于臨床，而骨髓基質干細胞經研究發(fā)現(xiàn)，在

2、體外一定條件下可向神經細胞分化，包括神經干細胞及神經元，同時具有取材方便，傳代穩(wěn)定等特點，因此應用骨髓基質干細胞治療腦外傷成為顱腦外傷治療的希望。
　　血清是細胞培養(yǎng)的重要成分，對細胞的分裂增殖及生命活動具有重要作用。但細胞分化對微環(huán)境的影響非常敏感，尤其在有血清培養(yǎng)體系的細胞分化實驗中，血清濃度高低可能導致分化結果迥異。本研究通過對不同血清濃度下，誘導人骨髓基質干細胞向神經細胞分化的效率的比較，初步探討了微環(huán)境對骨髓基質干細胞分

3、化的影響作用，發(fā)現(xiàn)低濃度血清對骨髓基質干細胞分化起促進作用，而高濃度血清起抑制作用，為骨髓基質干細胞的體外分化調控及臨床應用提供重要資料。
　　1、人骨髓基質干細胞的原代培養(yǎng)、鑒定
　　目的通過穩(wěn)定可靠的骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)模型，獲得大量骨髓基質干細胞。方法取志愿者骨髓Sml并于體外以密度為1.073g/mlPercoll分離液分離，吸取中間絮狀細胞層，以DMEM/F12+15％FBS進行培養(yǎng)，48h后發(fā)現(xiàn)細胞貼壁，換液后

4、繼續(xù)培養(yǎng)，7-8天見細胞鋪滿瓶底。結果7-8天后見細胞聚集成團，柵欄狀、漩渦狀排列，細胞呈梭形、星形或三角形，CD34、CD105免疫組化染色顯示，CD34陰性，CD105陽性。結論實驗中原代培養(yǎng)細胞為骨髓基質干細胞。
　　2、微環(huán)境對骨髓基質干細胞向神經細胞分化的影響
　　目的：通過對不同血清濃度下，誘導人骨髓基質干細胞向神經細胞分化的效率的比較，探討如何提高人骨髓基質干細胞向神經細胞分化率。方法：體外培養(yǎng)獲得原代骨髓基質

5、干細胞，鑒定后取第3代培養(yǎng)細胞，分別在1％，2％，5％，10％，15％，20％的血清濃度下用lOng/mlbFGF+lOng/mlEGF預誘導72h后，O.lumol/LRA、lOng/mlGDNF+lOng/mlBDNF正式誘導，并與無血清組比較，7天后進行熒光免疫組化染色，分別檢驗Nestin、NSE及GFAP的表達。
　　結果：各組經正式誘導ld后有部分BMSC開始收縮，細胞呈圓形，加血清組的BMSC生長速度快，細胞核分裂相

6、多，部分細胞出現(xiàn)神經元及神經膠質細胞形態(tài)，胞體呈錐形或圓形，有較長單極或多極的突起。熒光抗體染色后熒光顯微鏡觀察到，2％血清組NSE、nestin顯色最多，GFAP最少。
　　結論：bFGF、EGF和RA、GDNF、BDNF可以聯(lián)合誘導BMSCs向神經元樣細胞分化，而2％血清濃度可起促進作用，且神經元分化率最高。
　　3、自體骨髓基質干細胞移植對腦外傷后神經功能障礙患者治療作用的臨床觀察
　　目的：通過觀察自體骨髓基質

7、干細胞移植對外傷后神經功能障礙患者作用的效果，對細胞移植治療腦外傷的安全性及療效進行分析，為細胞移植工作進一步推廣奠定基礎。
　　方法：體外培養(yǎng)獲得原代骨髓基質干細胞，鑒定后取第3代培養(yǎng)細胞，經無菌測試合格，且經醫(yī)院倫理委員會同意，家屬簽字后，予1名外傷后植物生存狀態(tài)患者經顱置入Ommaya囊，經Ommaya囊注射骨髓基質干細胞至側腦室，細胞濃度為lxlOe5個/ml，另外2名患者通過鞘內注射干細胞的方法移植。
　　結果：移

8、植細胞一周后植物生存患者未出現(xiàn)發(fā)熱、癲癇等癥狀，肢體肌張力下降，持續(xù)一段時間后變高，3個月后四肢肌張力降低，眼球也由原來不能追蹤注視變?yōu)榭勺粉欁⒁?，頭顱CT檢查及PET-CT結果顯示：有患側顳葉有新生腦組織及腦組織的代謝。另2名患者移植后均出現(xiàn)不同程度的好轉，表現(xiàn)為肌張力下降，肌力恢復。3名患者的腦脊液BDNF濃度均在術后1、3、5、7天逐漸升高，14天后下降。
　　結論：骨髓間充質干細胞移植治療顱腦損傷后神經功能缺失不僅在理論上