豬骨髓干細(xì)胞體外分化和優(yōu)化移植治療急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、探討豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)增殖和分化潛能的不均一性，以及自發(fā)分化和5-氮胞苷誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的潛能。 方法：抽取中華小型豬骨髓，密度梯度離心法[Percoll(1．077g/ml)]分離出單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)法篩選MSCs，原代(PO)培養(yǎng)后按1：3比例每3天傳代一次。選取第1，4，8和10代(P1，P4，P8和P10)MSCs，研究其向心肌樣細(xì)胞自發(fā)分化潛能，以及在5

2、-氮胞苷誘導(dǎo)后4周能否分化為心肌細(xì)胞。連續(xù)鏡下觀察其形態(tài)變化。計(jì)數(shù)法分析MSCs增殖模式。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)MSCs的表面標(biāo)志(CD34、CD45、CD90和SH2)及心肌細(xì)胞特異性的蛋白表達(dá)，包括a-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(a-sarcomeric actin，a-actin)、心肌肌鈣蛋白-T(cardiactroponin-T，cTn-T)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和連接蛋白43(connexin

3、43，Cx43)。。透射電鏡觀察分化細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：體外培養(yǎng)條件下，P1、P4、P8和大部分P10代MSCs形態(tài)一致，呈梭形成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，但部分P10代細(xì)胞多核、胞漿延長(zhǎng)、和鄰近細(xì)胞相互連接，轉(zhuǎn)變?yōu)榧」軜有螒B(tài)。5-氮胞苷誘導(dǎo)1周后，部分P1、P4和P8代MSCs表現(xiàn)為較長(zhǎng)的胞漿形態(tài)和多核化，4周后更多細(xì)胞相互連接形成不規(guī)則的管樣結(jié)構(gòu)，而P10代MSCs則形成相對(duì)規(guī)則的肌管樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：1.豬骨髓MSCs在體外

4、自然培養(yǎng)條件下，形態(tài)學(xué)、增殖能力和分化潛能是不均一的，從P10代開始增殖變慢、部分細(xì)胞自發(fā)分化為心肌樣細(xì)胞。2.5-氮胞苷可誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，但是P10代MSCs分化的心肌細(xì)胞更趨成熟，具有相對(duì)成熟的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且分化效率更高。 二、研究<'18>氟-脫氧葡萄糖(<'18>fluoro deoxy-glucose，<'18>F FDG)標(biāo)記的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)經(jīng)冠狀動(dòng)脈輸

5、注后在急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)豬模型的早期全身分布、心肌內(nèi)定位和對(duì)心功能的影響。 方法：選取10月齡中華小型豬14頭(30±5kg)，分為對(duì)照組(經(jīng)冠脈輸注PBS，n=7)和移植組(經(jīng)冠脈輸注自體骨髓MNCs，n=7)。開胸后于緊靠第一對(duì)角支開口稍遠(yuǎn)處，膠管套扎左前降支(left anterior descending，LAD)冠狀動(dòng)脈90分鐘制備AMI模型。AMI后1周，抽取

6、自體骨髓分離出MNCs，以放射性同位素<'18>F-FDG(5mCi=185MBq)和熒光染料DAPI標(biāo)記，調(diào)密度至1×10<'9>細(xì)胞/10ml。以over-the-wire balloon球囊導(dǎo)管在LAD結(jié)扎處阻斷前向血流，同時(shí)輸注標(biāo)記的MNCs(1×10<'9>細(xì)胞/豬，n=6)，1小時(shí)后以雙核素(<'18>氟/<'99>锝)-單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(single photon emission computed tomogra

7、phy，SPECT)檢測(cè)其全身分布和心臟內(nèi)定位。以核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢測(cè)心功能。終點(diǎn)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)束后處死動(dòng)物進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，免疫組化法檢測(cè)MNCs在梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)分化潛能以及毛細(xì)血管密度。 結(jié)果：AMI后24h內(nèi)對(duì)照組和移植組分別有一只動(dòng)物死于心力衰竭和心室顫動(dòng)。<'18>FFDG標(biāo)記后即刻，MNCs活力達(dá)97％以上，標(biāo)記后1小時(shí)仍在93％以上，與非標(biāo)記MNCs相似。放

8、射活性檢測(cè)表明，90.8±1.9％的放射性活性存留于MNCs中，上清液中放射性活性小于10％。DAPI對(duì)活細(xì)胞的標(biāo)記效率為100％?；€時(shí)對(duì)照組和移植組心肌灌注缺損面積無(wú)顯著差異(47.1±7.5％vs45.6±6.6％，P=0.713)，終點(diǎn)時(shí)，移植組灌注缺損面積顯著小于對(duì)照組(23.9±5.1％。H&E染色和Masson’s三色染色結(jié)果顯示，對(duì)照組心肌梗死區(qū)有嚴(yán)重纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，存活心肌較少，而移植組纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，

9、且伴有存活心肌。免疫熒光顯示DAPI標(biāo)記的細(xì)胞表達(dá)心肌和血管特異性的結(jié)構(gòu)蛋白，包括α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白、心肌肌鈣蛋白T、連接蛋白43、Von Willebrand因子和血管平滑肌肌動(dòng)蛋白。與對(duì)照組比較，移植組梗死區(qū)(1.8±0.5 vs 3.7±1.1/HPF,P<0.003)和梗死周邊區(qū)(8.7±2.0 vs 4.9±1.3/HPF,P<0.003)毛細(xì)血管密度均顯著增加。 結(jié)論：研究表明：1.<'18>F-FDG標(biāo)記和雙核素S

10、PECT顯像可以用于監(jiān)測(cè)骨髓MNCs經(jīng)冠脈輸注后全身分布和心肌內(nèi)定位。2.經(jīng)冠脈輸注骨髓MNCs可顯著減小灌注缺損面積、改善心功能和阻止心室重塑。 三、探索性研究以通心絡(luò)超微粉和他汀類藥物改良急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)豬模型的心肌微環(huán)境，對(duì)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyrmal stem cells，MSCs)在體存活、分化和生物學(xué)活性的影響。 方法：56只中華小

11、型豬(30±5kg)分為8組，每組7只：對(duì)照組、MSCs移植組、單純通心絡(luò)超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀干預(yù)組、三種藥物改良+MSCs移植組。開胸結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈90min制備AMI模型，再灌注后隨即于梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)心肌內(nèi)注射自體骨髓MSCs(3×10<'7>細(xì)胞/500μl)，對(duì)照組以相同方法注射500μl低糖DMEM培養(yǎng)基。在6個(gè)藥物干預(yù)組，分別于AMI前3天開始給予口服小劑量通心絡(luò)超微粉(0.05g/d.kg)、辛伐他汀(0

12、.25mg/d.kg)和阿托伐他汀(0.25mg/d.kg)，AMI當(dāng)天和其后繼續(xù)使用4天。 結(jié)果：SPECT掃描顯示，基線時(shí)各組心肌灌注缺損面積無(wú)顯著差異(51.8±16.5％，46.5±9.2％，47.9±12.2％，52.7±15.5％，49.7±16.8％，53.7±14.9％，48.9±15.9％vs 50.7±14.5％，P>0.05)。MRI檢測(cè)顯示，各組心功能參數(shù)在基線時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05)。Western

13、 blot檢測(cè)顯示，對(duì)照組梗死區(qū)IL-1β，IL-6和TNF-α表達(dá)較Sham組顯著升高(P<0.0001)，和對(duì)照組相比，MSCs組、三種藥物干預(yù)組和藥物改良的MSCs移植組梗死區(qū)上述因子表達(dá)均顯著降低(P<0.0001)。 結(jié)論：1.在AMI再灌注后即刻心肌內(nèi)移植自體骨髓MSCs，其存活和分化能力有限，盡管能抑制促凋亡蛋白和部分炎癥因子的表達(dá)，但并未產(chǎn)生顯著的心功能獲益。2.圍移植期使用通心絡(luò)超微粉、辛伐他汀和阿托伐他汀可顯