骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化及體內(nèi)移植治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化及體內(nèi)移植治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究目的神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及其分離鑒定、培養(yǎng)技術(shù)的建立，使神經(jīng)細(xì)胞不可再生的傳統(tǒng)理論面臨巨大挑戰(zhàn)，并為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。但神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量少、分布分散，體外培養(yǎng)時(shí)取材困難，無(wú)免疫原性神經(jīng)干細(xì)胞系建立困難，以及異體移植的種屬差異和社會(huì)學(xué)、倫理學(xué)等方面的問(wèn)題都極大地限制了神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用。成體動(dòng)物的骨髓中存在一定數(shù)量的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在適當(dāng)條件下

2、可以向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究工作已有一定突破，但誘導(dǎo)形成的神經(jīng)元樣細(xì)胞存在著存活時(shí)間不長(zhǎng)，24小時(shí)后大多死亡的問(wèn)題。故如何延長(zhǎng)MSCs源性的神經(jīng)元樣細(xì)胞的壽命是極為重要的。另一方面MSCs移植治療缺血性腦損傷雖己取得一定的進(jìn)展，但MSCs移植后在體內(nèi)環(huán)境下分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比率較大而分化為神經(jīng)細(xì)胞的比率較小，所以如將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，再行細(xì)胞移植將會(huì)有事半

3、功倍的效果。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和純化，測(cè)定MSCs的細(xì)胞活力、生長(zhǎng)曲線和貼壁率，用形態(tài)學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。將培養(yǎng)成功的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外傳代、擴(kuò)增，以得到一定數(shù)量的細(xì)胞。以褪黑素(MT)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)予以干預(yù)，以期延長(zhǎng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞的存活時(shí)間，并應(yīng)用生存時(shí)間較長(zhǎng)的MSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞，對(duì)局灶性腦缺血大鼠模型(MCAO)進(jìn)行細(xì)胞移植。觀察植入細(xì)胞的分

4、布及存活情況，并探討細(xì)胞植入后對(duì)MCAO大鼠腦神經(jīng)元C-myc、Erk蛋白及其mRNA表達(dá)的影響。 材料和方法 (一)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增純化 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離：應(yīng)用貼壁法結(jié)合密度離心法分離大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。 2.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增純化：建立大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增純化體系，為實(shí)驗(yàn)提供種子細(xì)胞。 3.臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力。 4.骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁率檢測(cè)。

5、 5.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定：應(yīng)用免疫熒光法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的體表標(biāo)記，CD45、CD90。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的體表標(biāo)記，CD34、CD44。 (二)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究 1.MSCs的培養(yǎng)和純化。 2.MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化：應(yīng)用MT、bFGF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。 3.誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫熒光法鑒定：免疫熒光法鑒定分化細(xì)胞NSE、GFAP的

6、表達(dá)。 (三)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化后移植、治療局灶性腦缺血大鼠的實(shí)驗(yàn)研究 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增。 2.體外MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，分化后細(xì)胞在體外以BrdU進(jìn)行標(biāo)記。 3.大鼠腦局灶性缺血模型(MCAO)的制作及神經(jīng)功能評(píng)分。 4.大鼠MSCs源神經(jīng)元樣細(xì)胞經(jīng)頸動(dòng)脈注入MCAO模型。 5.BrdU標(biāo)記細(xì)胞的免疫組化染色：觀察植入細(xì)胞的成活率。 6.免疫組

7、化染色法測(cè)定大鼠腦內(nèi)C-myc、Erk，原位雜交法測(cè)定Cmyc、ErkmRNA。觀察細(xì)胞植入對(duì)上述指標(biāo)的影響。 結(jié)果 (一)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增純化 1.接種1周后細(xì)胞集落迅速增多，隨著集落不斷擴(kuò)大，互相融合，10-12天細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞以梭形和園形為主。 2.傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞不再以成集落方式生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度比原代要快。 3.P1、P3、P5代MSCs三代細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的貼壁率無(wú)

8、顯著性差異。 4.傳代大鼠MSCs潛伏期為1-2天，從第3天起細(xì)胞大量增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天達(dá)到高峰期，以后進(jìn)入平臺(tái)期。 5.MSCs表達(dá)CD90、CD44而不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34、CD45。 (二)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究 1.加入含MT、bFGF的培養(yǎng)液后，3天后見(jiàn)部分細(xì)胞胞體收縮，折光性增強(qiáng)，伸出突起，部分細(xì)胞胞體收縮成三角形，并有些成為簡(jiǎn)單的雙極細(xì)胞或多極細(xì)胞。

9、 2.誘導(dǎo)72小時(shí)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)NSE，9-14天陽(yáng)性細(xì)胞增多，以MT+bFGF組變化顯著，而不表達(dá)GFAP。 3.誘導(dǎo)分化前Erk蛋白在MSCs胞漿中只有微弱的表達(dá)，而在誘導(dǎo)的3天后Erk陽(yáng)性細(xì)胞大量出現(xiàn)。 (三)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化后移植、治療局灶性腦缺血大鼠的實(shí)驗(yàn)研究 1.MCAO大鼠細(xì)胞植入后神經(jīng)功能評(píng)分較對(duì)照組明顯改善。 2.細(xì)胞植入組大鼠腦內(nèi)48小時(shí)在損傷側(cè)腦中見(jiàn)散在BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，7天

10、后BrdU陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，14天時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不再增多。 3.MCAO大鼠在細(xì)胞植入48小時(shí)內(nèi)，在基底節(jié)、皮層、海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞均可見(jiàn)C-mycmRNA陽(yáng)性細(xì)胞。 4.MCAO大鼠腦中Erk蛋白、Erkm-RNA陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞植入24-48小時(shí)增多。1周后Erk蛋白陽(yáng)性細(xì)胞仍保持在較高比例。 結(jié)論 1.密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合是分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞簡(jiǎn)便·3·高效的方法，大量擴(kuò)增MSCs是可能的。MSC