自體骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后移植治療肝炎后肝硬化的臨床研究.pdf

1、目前肝移植是治療末期肝病的一種有效的治療方法,但由于供體缺乏、免疫排斥和高額費(fèi)用等一系列的問題,以至于肝移植的臨床運(yùn)用受到限制,難以滿足眾多的肝病患者治療的需求。眾多的肝病學(xué)家們也一直在探索一種可以補(bǔ)充的甚至于能夠代替肝移植來治療肝臟疾病的方法。隨著細(xì)胞學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,使得應(yīng)用肝干細(xì)胞來治療肝臟疾病成為可能。肝干細(xì)胞可以分化為與其自身的基因一致的肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞,作為肝干細(xì)胞的一種,骨髓源性肝干細(xì)胞(Bone marrow deri

2、ved liver stem cells,BMDLSC)的發(fā)現(xiàn),為肝臟疾病治療提供了新的思路和手段。利用骨髓源性肝干細(xì)胞移植的方法來修復(fù)因疾病而損傷肝臟,這是一種全新的肝病治療方法,該技術(shù)可以修補(bǔ)因等各種因?yàn)閾p傷而減少的肝細(xì)胞數(shù)量,可以重建因?yàn)楦螕p傷而遭到破壞的肝臟的組織結(jié)構(gòu)。
　　 近年來,國內(nèi)外已有眾多專家在研究如何利用肝干細(xì)胞來治療肝硬化等終末期肝病的課題。取得了一定的成果,但也存在許多尚待解決的問題。在現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料中,

3、絕大多數(shù)學(xué)者所采用的技術(shù)路線是:直接將抽取的骨髓進(jìn)行肝動脈或門靜脈輸注移植,或者將骨髓進(jìn)行簡單的離心分離后再經(jīng)肝動脈或門靜脈輸注移植。這種直接利用骨髓源性肝干細(xì)胞進(jìn)行移植的技術(shù)路線,雖然在方法上相對簡單易行,但最終效果都不夠理想,因?yàn)槭荁MDLSC在骨髓細(xì)胞中的含量非常稀少,即使移植較大量的骨髓,BMDLSC的移植數(shù)量也往往不足。我們采用的技術(shù)路線是骨髓源性肝干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后再行肝內(nèi)移植。這種技術(shù)路線在我們的前期動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)是

4、安全有效的,可以增加可供移植細(xì)胞中BMDLSC的數(shù)量,可以減少BMDLSC移植的骨髓需要量,從而提高BMDLSC移植的肝病治療效果。
　　 自2004年開始探索利用骨髓源性肝干細(xì)胞修復(fù)肝臟疾病損傷的研究,建立了骨髓源性肝干細(xì)胞在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的有效技術(shù),可以有效的增加骨髓源性肝干細(xì)胞的移植數(shù)量,使移植細(xì)胞的數(shù)量和移植細(xì)胞定居在肝臟并發(fā)揮治療作用的數(shù)量都得到增加。本研究主要觀察臨床應(yīng)用自體骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后肝內(nèi)移植治療肝炎

5、后肝硬化的安全性與有效性。
　　 目的
　　 探索臨床自體骨髓源性肝干細(xì)胞在體外培養(yǎng)與擴(kuò)增后肝內(nèi)移植治療肝炎后肝硬化的安全性及其效果。
　　 材料和方法
　　 1.病例選擇:2008年1月至2009年4月入住南方醫(yī)院肝膽外科治療的肝炎后肝硬化患者中,符合入選條件的病人12例,其中女性3人、男性9人,平均年齡48.8歲(39-60歲)。病人按入院先后的半隨機(jī)方法分為治療組6例和對照組6例。所有的病人都有明確

6、的乙肝病史,肝功能檢查輕度至中度異常,Child-Pugh肝功能評分A～C級,組織病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)廣泛的纖維組織增生,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,假小葉及再生結(jié)節(jié)形成,符合臨床肝炎后肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2.自體骨髓源性肝干細(xì)胞的采集、體外培養(yǎng)與擴(kuò)增:治療組患者在接受脾切除、門奇靜脈斷流術(shù)治療前一周,在嚴(yán)格無菌操作條件下以髂后上棘為穿刺點(diǎn)行骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓30-40mL,并用肝素鹽水抗凝后,送專門的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行骨髓源性肝干細(xì)胞的分離

7、、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增；在無菌的細(xì)胞培養(yǎng)室中利用密度梯度離心法分離出富含CD117陽性細(xì)胞和CD184陽性細(xì)胞的骨髓單個(gè)核細(xì)胞群,然后將細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增7天,擴(kuò)增方案采用含10％自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加促肝細(xì)胞生長素(HGPF)、促血小板生長素(TPO)和白細(xì)胞介素3(IL-3),此方案在嚴(yán)格無菌的層流細(xì)胞培養(yǎng)室中完成；將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,供臨床移植使用,在前期的實(shí)驗(yàn)中用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定擴(kuò)增細(xì)胞中CD117陽性細(xì)胞和CD184

8、陽性細(xì)胞的數(shù)量變化。
　　 3.體外擴(kuò)增的自體骨髓源性肝干細(xì)胞的肝內(nèi)移植:在患者接受門奇靜脈斷流術(shù)中縫合關(guān)閉腹腔前,治療組中,以1mL注射器針頭穿刺肝固有動脈,經(jīng)肝動脈緩慢注入經(jīng)體外培養(yǎng)與擴(kuò)增處理的自體骨髓源性肝干細(xì)胞懸液(體積10毫升,細(xì)胞平均濃度0.5×107/m1),對照組經(jīng)肝動脈緩慢注入等體積的生理鹽水。術(shù)前術(shù)后兩組病人予以相同方案的預(yù)防感染、保護(hù)肝臟與對癥支持等治療。
　　 4.觀察指標(biāo)與方法
　　 4

9、.1癥狀與體征:內(nèi)容包括精神、食欲、體力、黃疽、腹水、下肢水腫、肝性腦病等。
　　 4.2、影像學(xué)檢查:術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月行肝臟CT及B超檢查,依據(jù)CT所示肝臟體積和肝臟密度(CT值)來評定肝硬化的程度及其變化。
　　 4.3、實(shí)驗(yàn)室檢查:術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月分別檢查(1)肝功能:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清白蛋白、血清總膽紅素；(2)凝血功能:凝血酶原時(shí)間；(3)肝纖維化指標(biāo):透明質(zhì)酸(HA

10、)、人Ⅲ型前膠原(HPCⅢ),此外我們還記錄了患者在移植術(shù)后的2周及1個(gè)月的上述的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,但此數(shù)據(jù)受影響的因素較多,只能作為臨床參考所用。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)以X±SD表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。對一般情況的性別、術(shù)前的人Ⅲ型膠原蛋白術(shù)前術(shù)后人Ⅲ型膠原蛋白變化值因不服從正態(tài)分布而采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)、性別構(gòu)成采用x2檢驗(yàn),術(shù)前術(shù)后的AST、ALT、TBIL、ALB

11、、PT、透明質(zhì)酸、術(shù)后的人Ⅲ型膠原蛋白及其余各項(xiàng)指標(biāo)的前后的差值均服從正態(tài)分布而采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及配對t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果
　　 1、患者術(shù)后3月均自覺癥狀較術(shù)前明顯好轉(zhuǎn),水腫、黃疸、腹水的體征亦較術(shù)前有不同程度的緩解。
　　 2、兩組病人術(shù)前的各項(xiàng)檢驗(yàn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,兩組病人的術(shù)后均未發(fā)現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥,治療組6例病人均未發(fā)生過敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)和其它不良反應(yīng)。
　　 3、肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶

12、、總膽紅素、血漿白蛋白、凝血酶原時(shí)間:治療組由(39±15)U/L、(64±21)U/L、(42.5±13.2)umol/L、(29.8±5.1)g/L、(15.1±1.7)s變?yōu)?24±10)U/L、(38±16)U/L、(23.5±5.5)umol/L、(34.2±5.0)g/L、(13.7±1.1)s；對照組由(38±8)U/L、(55±21)U/L、(31.0±9.9)umol/L、(30.0±2.6)g/L、(15.0±1.2

13、)s變?yōu)?40±13)U/L、(63±21)U/L、(29.1±9.5)umol/L、(28.2±2.7)g/L、(15.9±2.1)s,治療組優(yōu)于對照組(P<0.05);
　　 4、肝纖維化指標(biāo):透明質(zhì)酸、人Ⅲ型前膠原:治療組由(336.2±55.4)ng/mL、(218.8±109.4)ng/mL變?yōu)?290.5±54.3)ng/mL、(186.4±88.5)ng/mL、對照組由(340.5±73.7)ng/mL、(148.

14、1±15.6)ng/mL變?yōu)?342.9±67.9)ng/mL、(153.2±21.0)ng/mL治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)。
　　 5、術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月患者的CT及B超檢查并無明顯的變化。
　　 結(jié)論
　　 1.自體骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后肝內(nèi)移植是安全的,本研究中12例病人均未出現(xiàn)并發(fā)癥與副作用,自體骨髓源性肝干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與擴(kuò)增處理沒有改變干細(xì)胞的抗原特性。
　　 2.自體骨髓肝干細(xì)胞體外