自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)肝硬化肝臟門靜脈栓塞后剩余肝臟再生的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　手術(shù)切除仍然是目前治療肝癌的主要措施;然而由于術(shù)前肝功儲(chǔ)備不足以支持術(shù)后肝功的恢復(fù),80％的患者失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。研究顯示肝硬化或其他肝損傷存在的情況下,至少要保證40%的剩余肝臟體積才能減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。門靜脈栓塞術(shù)(Portalveinembolization,PVE))是一種擴(kuò)大剩余肝臟體積的重要措施,但由于合并肝硬化存在時(shí)門靜脈栓塞后剩余肝再生能力明顯受限,且明顯延長了術(shù)前等待時(shí)間;肝硬化肝臟PV

2、E后剩余肝臟體積擴(kuò)大的范圍僅在9.6%-14%左右。同時(shí)研究顯示經(jīng)歷了術(shù)前PVE治療的患者中,3-30%的患者也往往因剩余肝臟再生不足,或較長時(shí)間等待后因腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。在我國80%的肝癌患者合并有不同程度的肝硬化;更需迫切需要一種提高剩余肝體積的方法。
　　近年來干細(xì)胞移植逐漸成為一種新的包括肝癌在內(nèi)的肝病治療手段,為提高剩余肝體積提供了一種重要治療工具;特別是間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStemCell

3、s,MSCs)移植的應(yīng)用逐漸受到更多的重視。研究顯示MSCs是所有骨髓干細(xì)胞亞群中修復(fù)肝臟損傷能力最強(qiáng)的干細(xì)胞,在體外可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞、肝細(xì)胞等;具有較明確的改善肝硬化、促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞正逐漸成為具有應(yīng)用前景的再生藥物,并有可能成為細(xì)胞移植治療肝病的首要選擇。因此,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs)移植可能為促進(jìn)促進(jìn)肝硬化肝臟門靜脈栓塞后剩

4、余肝臟再生提供了一種重要方法。
　　TGF-β是促進(jìn)肝硬化并抑制肝再生的重要因子,在肝硬化肝臟中存在較高表達(dá)。同時(shí)在大量實(shí)驗(yàn)研究中顯示封閉TGF-β可明顯抑制纖維化;目前TGF-β1中和抗體已經(jīng)在包括肝纖維化在內(nèi)的各種疾病治療得到了廣泛應(yīng)用。研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin與TGF-β/Smad信號通路通過β-catenin存在交叉,下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)了MSCs向肝細(xì)胞的分化。因此推測封閉TGF-β1信號

5、能夠促進(jìn)MSCs向肝細(xì)胞,從而進(jìn)一步增強(qiáng)自體BMSCs移植促進(jìn)PVE后剩余肝臟再生的效果。
　　綜上所述,本課題在通過四氯化碳腹腔注射建立的大鼠肝硬化模型中,對自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能否促進(jìn)肝硬化肝臟門靜脈栓塞后剩余肝臟再生進(jìn)行了研究,同時(shí)研究了其可能的潛在機(jī)制。另外對TGF-β1抗體能否對進(jìn)一步提高自體骨髓MSCs移植促進(jìn)肝硬化肝臟PVE后剩余肝臟再生進(jìn)行了初步探討。
　　主要材料方法：
　　自體骨髓MSCs移植促

6、進(jìn)肝硬化肝臟PVE后剩余肝臟再生的研究;
　　1、CCl4誘導(dǎo)肝硬化模型:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用腹腔注射CCl4方法,給予200-250g大鼠SD大鼠飲水中按照0.4g/L比例加入苯巴比妥誘導(dǎo)4天,而后腹腔內(nèi)注射用橄欖油1:1稀釋過的CCl4(3mL/kg,2次/w)8周;飲水中加入15%(V/V)的酒精。
　　2、自體骨髓BMSCs的分離及鑒定:無菌條件下抽取大鼠下肢骨髓后采用梯度離心及貼壁粘附法相結(jié)合分離BMSCs;以CD29

7、+、CD90+、CD45-、IGg同型對照為抗原標(biāo)志,利用流式細(xì)胞儀鑒定BMSCs。同時(shí)研究其在體外的多向分化潛能;來驗(yàn)證所分離的細(xì)胞就是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　3、PKH26-GL標(biāo)記:所分離的BMSCs用PKH26染色標(biāo)記,用于視蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的分布。
　　4、肝硬化肝臟PVE模型(根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行):肝硬化模型建立后乙醚吸入麻醉下,上腹部正中開腹暴露肝臟及其門靜脈,解剖顯微鏡下分離、結(jié)扎左中葉(占總肝體積70%)門靜脈

8、,用注射器向左、中門靜脈中灌注用碘化油1ml(泛影葡胺稀釋1:1)。
　　5、肝細(xì)胞移植:在建立PVE后向門靜脈主干注射分離的2×106自體BMSCs。實(shí)驗(yàn)組注射DMEM培養(yǎng)液,假手術(shù)組建立肝硬化后僅僅行開關(guān)腹,不予行PVE及細(xì)胞移植。
　　6、肝再生指標(biāo)測定:剩余肝臟占總重量百分比、Ki-67標(biāo)記指數(shù)、肝功。A:剩余肝臟占總重量百分比:右肝+尾葉/總肝重量。
　　B.Ki-67標(biāo)記指數(shù):采用免疫組化法,ki-67陽性

9、細(xì)胞百分百。
　　C.肝功測定:適時(shí)處死動(dòng)物后抽取下腔靜脈血液做肝功分析(自動(dòng)生化儀),檢測血清ALT、AST、ALB、TBIL水平。
　　7、增生機(jī)制的研究指標(biāo):
　　A:剩余肝臟內(nèi)的膠原沉積堅(jiān)持,羥脯氨酸測定、馬松染色、HE染色。
　　B:RT-PCR測定剩余肝臟的HGF、VEGF、MMP-9及IL-10基因表達(dá)。
　　C:利用共聚焦技術(shù)檢測BMSCs在肝組織內(nèi)肝細(xì)胞的分化,檢測AFP、CK18、ALB

10、的表達(dá)。
　　8、在肝細(xì)胞分化液(HGF(10ng/Ml)+FGF-4(10ng/Ml)中加入不同濃度的TGF-β(0ng/ml,5ng/mland10ng/mlrespectively)。培養(yǎng)7天后通過RT-PCR檢測AFP基因的表達(dá),培養(yǎng)14天、28天同樣方法分別測定CK18、ALB的表達(dá);用于研究TGF-β對BMSCs向肝細(xì)胞分化的影響。
　　9、用DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs過程中,加入TGF-β,通過Am-

11、Blue試劑盒研究TGF-β對BMSCs增殖的影響。
　　10、TGF-β1單克隆抗體((Chemicon,Hampshire,UnitedKingdom)作為拮抗劑:PVE建立后由尾靜脈靜脈管注射1mlPBS+20ugTGF-β1單克隆抗體,每周2次,分為手術(shù)7、14、28天,每時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物被處死6只。檢測肝臟再生指標(biāo);右肝+尾葉/總肝重量。
　　結(jié)果：
　　1.BMSCs移植組比對照組明顯提高了PVE后14天、28天

12、肝右葉+尾狀葉/總肝重量的比值(67.05±8.13versus54.67±8.23,p=0.026,71.77±4.06versus63.63±7.03,p=0.043).
　　2.BMSCs移植組比對照組明顯提高了PVE后14天、28天Ki-67標(biāo)記指數(shù)(27.50±3.78vs.21.00±2.37atday14,p=0.002;24.83±3.06vs.17.50±1.87atday28,p=0.001)。
　　3.

13、BMSCs移植組比對照組明顯提高了PVE后14天、28天血清白蛋白水平及降低了血清總膽紅素水平。
　　4.術(shù)后7天,ALT水平BMSCs組較對照組明顯降低,但術(shù)后28天BMSCs組較對照組明顯提高了ALT水平。術(shù)后7天AST水平兩組間無明顯差別,但術(shù)后14、28天,BMSCs組較對照組明顯提高血清AST水平。
　　5.術(shù)后14、28天,BMSCs組比對照組明顯降低了右肝內(nèi)膠原沉積。
　　6.術(shù)后28天,BMSCs移植明

14、顯提高了剩余肝臟內(nèi)HGF、VEGF、MMP-9及IL-10基因水平。
　　7.BMSCs在肝內(nèi)以時(shí)間依賴的順序表達(dá)了AFP、CK18、ALB。8.TGF-β明顯抑制了BMSCs的增殖活性。
　　9.TGF-β明顯抑制了BMSCs向肝細(xì)胞的分化。
　　10.TGF-β1單克隆中和抗體抗體及BMSCs的聯(lián)合應(yīng)用較單獨(dú)移植BMSCs,不能明顯提高了肝右葉+尾狀葉/總肝重量的比值。
　　結(jié)論：
　　1.BMSCs能

15、夠在體內(nèi)分化為肝細(xì)胞。
　　2.BMSCs能夠緩解肝硬化。
　　3.自體BMSCs移植能明顯提高肝硬化肝臟PVE后剩余肝臟再生。
　　4.可能機(jī)制是BMSCs移植后肝細(xì)胞再生的微環(huán)境得到明顯改善,及通過改善肝硬化狀體,提高HGF、VEGF、MMP-9及IL-10;從而刺激內(nèi)源性的肝細(xì)胞增生。
　　5.TGF-β能明顯抑制BMSCs的增生。
　　6.TGF-β能夠明顯抑制BMSCs向肝細(xì)胞的分化。