骨髓間充質(zhì)干細胞參與移植物動脈硬化的機制研究.pdf

1、研究背景：移植物動脈硬化是各種器官移植物發(fā)生慢性移植物失功的共同病理變化。移植物動脈新生內(nèi)膜增生所致管腔狹窄，引起移植器官的血供不足和纖維化，被認為是移植物功能進行性惡化的首要原因。近來研究發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜平滑肌細胞是受體起源，95%以上是平滑肌細胞，多種細胞可以參與新生內(nèi)膜的增生并分化成平滑肌細胞。在不同的模型中顯示，骨髓細胞是否參與血管新生內(nèi)膜增生與中膜平滑肌損傷程度有關，只有在嚴重損傷的情況下，骨髓細胞才被動員參與血管修復、新生內(nèi)膜增

2、生。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，能夠參與各種損傷組織的修復。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能夠分化成為平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞，是否參與移植物動脈硬化目前尚不清楚，因此研究間充質(zhì)干細胞是否參與移植物動脈硬化，誘導中膜平滑肌細胞大量凋亡能否促進間充質(zhì)干細胞參與移植物動脈硬化，對進一步闡明移植物動脈硬化的發(fā)病機制及提供有效的防治策略具有重要的理論意義和應用前景。
　　 目的：構建穩(wěn)定表達EGFP

3、的骨髓間充質(zhì)干細胞，明確骨髓間充質(zhì)干細胞是否參與移植物動脈硬化，構建組織特異性SM22α啟動子驅(qū)動P53基因慢病毒載體，誘導血管平滑肌細胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖和遷移的影響，體內(nèi)參與移植物動脈硬化的影響，探討骨髓間充質(zhì)干細胞參與移植物動脈的機制。
　　 方法：采用常規(guī)血管環(huán)貼壁法、酶消化法，改良血管環(huán)貼壁法培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，有限稀釋法純化內(nèi)皮細胞，采用組織塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞。PCR擴增組織特異性的SM22

4、α啟動子，構建以此為啟動子的慢病毒載體，體外感染大鼠主動脈平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞；原代培養(yǎng)并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀測定細胞表面標志,體外誘導分化進行鑒定，將攜帶EGFP的慢病毒載體體外感染骨髓間充質(zhì)干細胞，構建能夠穩(wěn)定表達EGFP的BMMSC-EGFP；建立大鼠主動脈移植模型，將骨髓間充質(zhì)干細胞從尾靜脈輸入受體大鼠體內(nèi)，組織學檢查判定移植物動脈硬化，在熒光顯微鏡下觀察移植物中表達EGFP的細胞；構建SM22α啟動子驅(qū)動的P5

5、3慢病毒載體，體外感染平滑肌細胞誘導凋亡，Hoechst 33258 染色和Annextin V-FITC/PI染色流式細胞儀測定平滑肌細胞的凋亡，收集并濃縮細胞凋亡上清，CCK-8法測定細胞凋亡上清對間充質(zhì)干細胞的增殖作用，Transwell 小室法測定凋亡上清對間充質(zhì)干細胞趨化遷移的影響；SM22α啟動子驅(qū)動的P53 慢病毒載體離體感染主動脈移植物，TUNEL 測定中膜平滑肌細胞的凋亡，熒光顯微鏡觀察移植物中表達EGFP的細胞。

6、r>　　 結(jié)果：改良血管環(huán)貼壁法培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的效果最佳，并以此采用有限稀釋法純化得到無雜細胞的內(nèi)皮細胞，組織塊法適合動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)。
　　 PCR 擴增的SM22α啟動子經(jīng)測序鑒定符合要求，成功構建了以此為啟動子的慢病毒載體，體外能夠特異驅(qū)動報告基因在大鼠主動脈平滑肌細胞中的表達。全骨髓貼壁法得到的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)流式細胞儀鑒定表面標志均證實是高純度骨髓間充質(zhì)干細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能夠分化成脂

7、肪、血管平滑肌細胞和成骨細胞，pH穩(wěn)定的培養(yǎng)基對于骨髓間充質(zhì)干細胞的長期傳代培養(yǎng)是必須的。慢病毒能夠高效感染骨髓間充質(zhì)干細胞，凝聚胺能夠提高感染效率，感染后的骨髓間充質(zhì)干細胞長期穩(wěn)定表達EGFP。移植物主動脈發(fā)生典型的移植物動脈硬化病變，在熒光顯微鏡下觀察到表達EGFP的細胞成多層聚集于新生內(nèi)膜靠近管腔處；成功構建SM22α啟動子驅(qū)動的P53 慢病毒載體，體外感染動脈平滑肌細胞在凋亡刺激劑存在的條件下能夠誘導凋亡，細胞凋亡上清對骨髓間充